高血壓病合并心房顫動患者ACE多態性與TGFβ1/CTGF的關系

林憲如，任永強，史 悅，吳 娜，馬 穎，王正忠，王海洋

(青島市立醫院心內科，山東 青島 266011)

高血壓病合并心房顫動患者ACE多態性與TGFβ1/CTGF的關系

林憲如，任永強，史 悅，吳 娜，馬 穎，王正忠，王海洋

(青島市立醫院心內科，山東 青島 266011)

目的探討高血壓病(EH)合并心房顫動(AF)患者血管緊張素轉換酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多態性與轉化生長因子β1(TGFβ1)、結締組織生長因子(CTGF)的關系。方法選擇75例EH合并AF患者分為陣發性AF組(EH+pAF，44例)和慢性AF組(EH+cAF，31例)，記錄一般臨床資料及行超聲心動圖檢查，用ELISA法測定血清TGFβ1、CTGF，用PCR方法檢測ACE基因插入/缺失(I/D)多態性，并與EH且為竇性心律(SR)組(EH+SR，37例)及健康對照者(NC，36例)進行比較；比較EH+AF組不同基因型間TGFβ1與CTGF的血清濃度。結果EH+ cAF組和EH+pAF組血清TGFβ1及CTGF水平均顯著高于EH+SR組和NC組(P＜0.01)；EH+AF組與EH+SR組、NC組ACE I/D多態性缺失純合型(DD型)、雜合子(DI型)、插入純合型(II型)基因型頻率比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，但D等位基因分布頻率在EH+AF組中較EH+SR組和NC組明顯增加(P＜0.05)；EH+AF組不同基因型之間TGFβ1及CTGF濃度比較發現，DD基因型TGFβ1濃度顯著高于DI型(P＜0.01)和II型(P＜0.01)，DD基因型CTGF濃度明顯高于II型(P＜0.05)。結論D等位基因可能是高血壓病合并心房顫動的易患基因；房顫患者ACE DD基因型TGFβ1和CTGF水平明顯升高，藉此可引起心房肌纖維化及心房重構，導致房顫的發生和發展。

高血壓病；心房顫動；血管緊張素轉換酶基因插入/缺失多態性；轉化生長因子β1；結締組織生長因子

臨床流行病學及薈萃分析發現，孤立性或家族性心房顫動(Atrial fibrillation，AF，簡稱房顫)與血管緊張素轉換酶(ACE)多態性有關[1-2]，其中，房顫與ACE基因插入/缺失(I/D)多態性研究最多[3]。然而，高血壓病導致的房顫是否與ACE I/D多態性有關則目前報道較少。本研究分析高血壓病合并房顫與ACE I/D基因多態性的關系，并探討不同基因型與轉換生長因子(TGFβ1)及結締組織生長因子(CTGF)之間的關系，旨在分子水平上探討腎素-血管緊張素系統與房顫發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3～11月在我院心內科住院的高血壓病合并房顫患者75例，其中陣發性房顫(EH+pAF組)44例、慢性房顫(EH+cAF組，房顫持續≥6個月)31例，房顫的診斷均經心電圖或Holter證實。選擇同期住院的高血壓病合并竇性心律(Sinus rhythm，SR)患者37例(EH+SR組)及來自我院查體中心的健康人群36例(NC組)作為對照。所有高血壓病患者記錄及收集臨床資料，行心臟彩超檢查。

1.2 排除標準 入選患者排除繼發性高血壓、急性冠脈綜合征、陳舊性心肌梗死、瓣膜性心臟病、心肌病、肺心病、先心病及其他各種類型心律失常。80歲以上、3個月內服用RAS抑制劑(ARB、ACEI類藥物)、腦卒中、腎臟受損、進行過大手術、近期正在服用抗炎藥物或Ⅰ、Ⅲ類抗心律失常藥物者、兩周內有任何感染史及惡性腫瘤、肝臟與肺纖維化的患者亦排除在外。

1.3 標本采集 入選研究對象清晨采取空腹靜脈血5 ml，置于干凈的凝膠真空管內，室溫下凝固30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液立即分裝，置-80℃冰箱保存，待測TGFβ1和CTGF。分離出的血細胞同時置于-80℃冰箱保存，用于提取DNA。

1.4 檢測方法

1.4.1 TGFβ1和CTGF檢測 取一定量樣本行預實驗確定待測因子的最佳稀釋比例，然后統一采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)測定血清TGFβ1和CTGF含量。ELISA試劑盒購于上海逸晗生物科技有限公司(LOT：20121101A)，嚴格按照試劑盒說明進行操作，建立標準曲線，設立空白對照、陰性對照，控制板內變異系數＜10%，板間變異系數＜5%。

1.4.2 ACE基因型鑒定 將研究對象分離出的血細胞懸液解凍，按GENEray公司血液基因組DNA抽提試劑盒說明提取外周血DNA，擴增ACE基因片段PCR引物序列參照Rigat設計[4]：上游引物為CTGG AGACCACT CCCA TCCT TTCT，下游引物為GATG TGGC CATC ACAT TCGT AGAT。PCR條件為起始95℃預變性3 min，繼之95℃變性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30個循環；再以72℃延伸5 min，最終設定溫度為16℃，以瓊脂糖凝膠電泳判定基因型，同時選取PCR產物樣本測序鑒定。

1.5 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差()表示，組間比較應用獨立樣本t檢驗，多組比較使用方差分析，兩兩比較用q檢驗。計數資料應用交叉表χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 高血壓病合并房顫組與高血壓病竇性心律組間臨床指標比較 EH+cAF組、EH+pAF組及EH+ SR組患者的性別、年齡、體重指數、SBP、DBP、血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、室間隔厚度、左室后壁厚度及射血分數比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。然而，EH+cAF組患者左房內徑[(44.3±6.9)mm]明顯高于EH+pAF組[(37.4±5.0)mm](t=4.732，P＜0.005)和EH+SR組患者[(35.0±3.2)mm](t=6.888，P＜0.001)，而EH+pAF組左房內徑與EH+SR組差異無統計學意義；EH+cAF組左室內徑[(49.0±6.4)mm]亦明顯高于EH+SR組[(46.1±3.8)mm](t=2.286，P＜0.05)，而EH+pAF組左室內徑[(46.7±4.2)mm]與EH+SR組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組血清TGFβ1與CTGF水平比較 EH+ cAF組和EH+pAF組患者血清TGFβ1水平均明顯高于EH+SR組(分別為t=3.890，P＜0.001和t=2.293，P＜0.05)及NC組(分別為t=4.257，P＜0.001和t=2.762，P＜0.005)；血清CTGF水平在EH+cAF組和EH+pAF組患者亦均明顯高于EH+SR組(分別為t=96.078，P＜0.001和 t=32.807，P＜0.001)及 NC組(分別為 t= 198.609，P＜0.001和t=38.842，P＜0.001)，但EH+cAF組與EH+pAF組之間差異無統計學意義，見表1。

表1 各組TGFβ1與CTGF水平的比較()

表1 各組TGFβ1與CTGF水平的比較()

注：與EH+SR組和NC組比較，aP＜0.001，bP＜0.05。

EH+cAF組EH+pAF組EH+SR組NC組31 44 37 36 49.6±29.5a39.5±31.1b28.3±8.6 25.2±13.0 8162.6±206.0a7867.9±1295.3a1135.4±378.5 261.8±87.6

2.3 各組ACEI/D基因多態性分布頻率比較 EH+cAF組與EH+pAF組患者DD、II、DI基因型與EH+SR組及NC組患者相應基因型分布頻率差異無統計學意義；將EH+cAF組與EH+pAF組患者合并為EH+AF組，雖未發現合并后的EH+AF組DD、DI、II基因型與EH+SR組及NC組患者相應基因型分布頻率差異無統計學意義(P＞0.05)，但D等位基因分布頻率(56.7%)明顯高于EH+SR組(41.9%)和NC組(38.9%)(P＜0.05)，見表2。

表2 各組ACE I/D基因型與等位基因分布比較[例(%)]

2.4 EH+AF組患者不同基因型TGFβ1與CTGF水平比較 經單因素方差分析，EH+AF組患者ACE I/D不同基因型TGFβ1與CTGF水平差異有統計學意義。進一步兩兩比較發現，DD基因型TGFβ1水平明顯高于DI型(t=2.571，P＜0.05)和II型(t=2.840，P＜0.01)，而DI型與II型間TGFβ1比較差異無統計學意義(P＞0.05)。DD基因型CTGF水平亦顯著高于DI型(t=2.109，P＜0.05)和II型(t=5.069，P＜0.001)，而DI型與II型間比較CTGF水平差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 高血壓病合并房顫組不同ACE I/D基因型間TGFβ1、CTGF的比較()

表3 高血壓病合并房顫組不同ACE I/D基因型間TGFβ1、CTGF的比較()

注：與DD型比較，aP＜0.05；bP＜0.01。

基因型DD型DI型II型例數27 31 17 TGFβ1(ng/ml) 54.03±26.92 37.81±11.79a32.43±24.08bCTGF(ng/ml) 8.25±0.19 8.03±0.10a7.99±0.69b

3 討論

心房顫動是臨床上常見的心律失常，許多臨床研究表明，高血壓是導致心房顫動的重要危險因素[5-6]，在一項對醫院就診患者心房顫動的歸因調查中，高血壓病為最常見疾病，達40.3%，遠高于其他心血管疾病[7]。Go等[8]研究也發現，高血壓病者伴發心房顫動是血壓正常者的1.9倍。近些年來，心房顫動與ACE基因多態性的關系受到重視，有報道提示ACE多態性與心房顫動有關，DD型者發生房顫的風險明顯高于DI型和II型[3，9]，國內一項小規模的臨床研究雖未支持這一結論，但也發現房顫組D等位基因明顯高于對照組[10]。高血壓病合并的房顫是否與ACE I/D多態性有關，目前報道較少，常慧穎等[11]對非家族性和非孤立性心房顫動與ACE I/D基因多態性的關系進行了觀察，其結果與國外報道相似，研究對象中包含了少量高血壓患者，但并非專門針對高血壓病合并房顫的患者進行研究；另一項研究發現在45歲以下高血壓病合并房顫患者中D等位基因頻率(60%)高于單純高血壓組患者(41.7%)，但由于納入病例數極少而差異無統計學意義[12]。我們在研究中發現高血壓病合并房顫患者DD型高于竇性心律的高血壓病患者及正常對照人群，其結果差異無統計學意義，可能與入選患者病例較少有關，但D等位基因明顯高于另外兩組，提示ACE I/D基因多態性與高血壓病患者的房顫發生有關。

心房纖維化是房顫發生和發展的病理基礎。TGFβ1是重要的促纖維化細胞因子，可調節細胞外基質如膠原、蛋白多糖及纖維結合蛋白的合成，Verheule等[13]在轉基因大鼠實驗中曾證實，TGFβ1的過度表達可導致心房纖維化并使房顫易感性增強，但這些大鼠的心室并不出現纖維化改變，表明TGFβ1具有選擇性促心房纖維化作用。先前有研究表明，高血壓病患者ACE DD基因型血清前膠原Ⅲ顯著高于II和DI基因型，且D等位基因對左室肥厚和心肌纖維化的發生發展有著促進作用[14]。我們在研究中發現，高血壓病合并房顫組ACE DD基因型血清TGFβ1水平明顯高于DI及Ⅱ基因型，由此推斷ACE DD基因型可能是通過促進心房肌表達TGFβ1增加、從而促進心房肌纖維化而成為房顫的危險因素。ACE為二肽羧基肽酶，ACEI/D基因多態性在很大程度上決定了ACE水平，后者可促進AngⅡ的生成和釋放增加。AngⅡ通過作用于心肌細胞上的AT-1受體使TGFβ1表達增強，后者可通過刺激其下游調節物CTGF的分泌、促進心房肌組織纖維化形成。Darbar等[15]還發現，無論是高血壓合并房顫還是孤立性房顫患者，ACE DD型和DI型者抗心律失常藥治療的失敗率均明顯高于II型(P＜0.005)。對于高血壓病合并心房顫動患者，針對ACE基因多態性進行干預及優化抗心律失常藥物，可望在基因水平上為房顫的治療提供新的視角。

[1]Ravn LS,Benn M,Nordestgaard BG,et al.Angiotensinogen and ACE genepolymorphisms and risk of atrial fibrillation in the general population[J].Pharmacogenet Genomics,2008,18(6);525-533.

[2] Tsai CT,Hwang JJ,Chiang FT,et al.Renin-angiotensin system gene polymorphisms and atrial fibrillation:a regression approach for the detection of gene-gene interactions in a large hospitalized population[J].Cardiology,2008,11(1):1-7.

[3]Liu T,Korantzopoulos P,Xu G,et al.Association between angiotensin-converting enzyme insertion/deletion gene polymorphism and atrial fibrillation:a meta-analysis[J].Europace,2011,13:346-354.

[4]Rigat B,Hubert C,Cornorl P,et al.PCR detection of t he in serting/ deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene(DCPI)[J].NuelAcids Res,1992,20(6):1433-1437.

[5]Kistler PM,Sanders P,Dodic M,et al.Atrial electrical structural abnormalities in an ovine model of chronic blood pressure elevation after prenatal corticosteroid exposure:implications for development of atrial fibrillation[J].Eur Heart J,2006,27(24):3045-3056.

[6]Choisy SC,Arberry LA,Hancox JC,et al.Increased susceptibility to atrial tachyarrhythmia in spontaneously hypertensive rat hearts [J].Hypertension,2007,49(3):498-505.

[7]Wen-Hang QI.Society of Cardiology,Chinese Medical Association. Retrospective investigation of ospitalized patients with atrial fibrillation in mainland China[J].Int J Cardiol,2005,105(3):283-287.

[8]Go O,Rosendorff C.Hypertension and atrial fibrillation[J].Curr Cardiol Rep,2009,11:430-435.

[9]Gensini F,Padeletti L,Fatini C,et al.Angiotensin-converting enzyme and endothelial nitric oxide synthase polymorphisms in patients with atrial fibrillation[J].Pacing Clin Electrophysiol,2003, 26(1 Pt 2):295-298.

[10]魏 玲,劉 斌,李麗娟,等.血管緊張素轉化酶基因多態性與房顫心肌纖維化的相關性研究[J].西南國防醫藥,2007,17(6): 704-706.

[11]常慧穎,楊樹森,韓 微,等.非家族性心房顫動與血管緊張素基因I/D多態性關系的研究[J].黑龍江醫學,2007,31(10):731-733.

[12]王淑敏,張 萍,陳鳳榮,等.心房顫動與血管緊張素轉換酶基因多態性的相關性研究[J].中國實用內科雜志,2003,23(9): 537-538.

[13]Verheule S,Sato T,Everett T,et al.Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1[J].Circ Res,2004,94(11): 1458-1465.

[14]王云英,劉家玉,高 嶺.血管緊張素轉換酶基因多態性與原發性高血壓病心肌纖維化的關系[J].中國心血管雜志,2003,8(3): 171-173.

[15]Darbar,D,Motsinger AA,Ritchie MD,et al.Polymorphism modulates symptomatic response to antiarrhythmic drug therapy in patients with lone atrial fibrillation[J].Heart Rhythm,2007,4(6): 743-749.

Correlation between angiotensin converting enzyme gene polymorphisms and TGFβ1/CTGF in hypertensivepatients with atrial fibrillation.

LIN Xian-ru,REN Yong-qiang,SHI Yue,WU Na,MA Ying,WANG Zheng-zhong,WANG Hai-yang.

Department of Cardiology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011,Shandong,CHINA

ObjectiveTo explore the relationship between the polymorphisms of angiotensin converting enzyme(ACE)insertion/deletion(I/D)gene and transforming growth factor β1(TGFβ1)/connective tissue growth factor (CTGF)in patients with essential hypertension(EH)and atrial fibrillation(AF).MethodsSeventy-five EH patients with documented AF were divided into the paroxysmal AF group(EH+pAF group,n=44)or the chronic AF group (EH+cAF group,n=31),and 37 EH patients with sinus rhythm(SR)were selected into the EH+SR group.All clinical data including blood pressure,lipids,glucose and atrial diameter measured from ultrasonic cardiogram were recorded. Thirty-six healthy subjects from the medical examination center were assigned to normal controls(NC group).The serum TGF β1,CTGF were measured by ELISA method,and the genotypes of ACE(I/D)gene were identified by polymerase chain reaction(PCR)and PCR restricted fragment length polymorphism assay.TGF β1/CTGF concentration and ACE I/D genotypes were compared within different groups.ResultsThe serum TGF β1and CTGF levels of EH+ pAF and EH+cAF groups were significantly higher than those of EH+SR and NC group(P＜0.001,respectively).In spite of no difference of ACE I/D genotypes between the four groups,allele D genotype frequency in EH+AF group was significantly higher than that in EH+SR and NC groups(P＜0.05).Among the patients in EH+AF group,the serum TGF β1concentration was significantly higher in patients with DD genotype than in those with ID andⅡgenotypes (P＜0.05 and P＜0.01,respectively),and the serum CTGF level was also markedly higher in patients with DD genotype than in those with ID andⅡgenotypes(P＜0.05).ConclusionThe allele D may be the risk factor for AF in EH patients.The serum TGF β1/CTGF levels were markedly elevated in AF patients with DD genotype of ACE,which may cause atrial fibrosis and atrial remodeling,resulting in the occurrence and development of atrial fibrillation.

Hypertension;Atrial fibrillation;Angiotensin converting enzyme gene I/D polymorphisms;Transforming growth factor β1;Connective tissue growth factor

R544.1

A

1003—6350（2014）24—3610—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1409

2014-06-14)

任永強。E-mail：renyongqiang1981@sina.com