附子干姜配伍對阿霉素致大鼠慢性心衰的治療作用

梁 濤 耿 珊 周玲玲 葛華雯 王新宇

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

附子干姜配伍對阿霉素致大鼠慢性心衰的治療作用

梁 濤 耿 珊 周玲玲 葛華雯 王新宇

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的 觀察附子干姜配伍治療阿霉素（ADR）致慢性心衰的作用，并探討其作用機(jī)理。方法 采用鹽酸ADR腹腔注射方法，建立慢性心力衰竭大鼠模型，將SD大鼠隨機(jī)分為6組：對照組，模型組，附子高、低劑量組（3.3，1.65g/kg），附子干姜（1∶1）高、低劑量組（6.7，3.3g/kg）。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清中去甲腎上腺素（NE）、內(nèi)皮素-1（ET-1）和心臟組織中Na+-K+-ATPase的活性，運(yùn)用蛋白免疫印跡雜交法（Western Blot）檢測心臟組織蛋白Junctophilin-2（JP2）的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，附子和附子干姜配伍血清中NE及ET-1含量顯著降低，心臟組織中Na+-K+-ATPase含量及JP2的蛋白表達(dá)顯著升高，其中附子干姜（1∶1）高劑量組作用更顯著（P＜0.01）。結(jié)論 附子與附子干姜（1∶1）配伍對ADR致慢性心衰的作用，可能與其增加心臟組織Na+-K+-ATPase活性，上調(diào)Junctophilin-2（JP2）的蛋白表達(dá)有關(guān)。

附子 干姜 阿霉素 心力衰竭

慢性心力衰竭（CHF）是一組復(fù)雜的臨床綜合征，是多種心臟疾病的終末期表現(xiàn)。ADR是一種廣譜高效的蒽醌類腫瘤化療藥物，對白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的化療效果良好。長期大劑量使用會引起中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭［1］。在近幾年關(guān)于治療慢性心衰藥物的研究報道中，大多數(shù)是附子干姜配伍在抗氧化應(yīng)激，凋亡等方面的研究，對慢性心衰作用的發(fā)生機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)通過附子干姜配伍探究其治療ADR致慢性心衰的機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～220g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）：2007-0005］提供。自由飲水，室溫（20±2）℃，濕度50％～60％。SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，即對照組、模型組、附子高劑量組（3.3g/kg）、附子低劑量組（1.65g/kg）、附子干姜（1∶1）高劑量組（6.7g/kg）、附子干姜（1∶1）低劑量組（3.3g/kg）。對照組及模型組在造模同時每日灌胃0.9％氯化鈉注射液，兩附子組，附子干姜（1∶1）組等體積灌胃給藥，每日1次，連續(xù)16d，給藥體積1mL/100g。

1.2 試劑與儀器 附子（黑順片）、干姜原藥材購于南京解放軍第四五四醫(yī)院藥劑科，質(zhì)量符合《中國藥典》2010版一部規(guī)定；注射用鹽酸ADR，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：111003；內(nèi)參一抗（β-Actin），Immunoway；二抗（羊抗兔IgG-HRP），Jackson，批號111-035-003；Noradrenaline（NE）測定試劑盒、Endothelin 1（ET-1）測定試劑盒、Na+-K+-ATPase測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；全蛋白抽提試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；ECL檢測試劑盒，南京鷺飛生物技術(shù)有限公司。附子高劑量：稱取附子500g，加10倍量水浸泡30min，煎煮1h過濾，連續(xù)煎煮3次，合并3次濾液，于水浴鍋上濃縮至1.5L，即每mL相當(dāng)于生藥0.33g。附子低劑量：取附子高劑量，稀釋1/2。附子干姜（1∶1）高劑量：稱取附子、干姜各500g，加10倍量水浸泡30min，煎煮1h過濾，連續(xù)煎煮3次，合并3次濾液，于水浴鍋上濃縮至1.5L，即每mL相當(dāng)于生藥0.67g。附子干姜（1∶1）低劑量：取附子干姜高劑量，稀釋1/2，得附子干姜水煎液低劑量。電子天平，天津市天馬儀器廠，型號TD6001；分析天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司，型號FA1204B；華東電子酶標(biāo)儀，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，型號DG5033A；Western電泳儀，美國Bio-Rad，型號164-5051；PVDF膜，PALL，型號65421；高速冷凍離心機(jī)，美國科俊儀器公司，型號SH03014；電熱恒溫干燥箱，上海潤東榮豐科學(xué)儀器有限公司，型號101-AS-3；多用脫色搖床，江蘇金壇市正基儀器廠，型號HY-4。

1.3 模型制備 參照文獻(xiàn)進(jìn)行改進(jìn)［2］，采用鹽酸ADR造模，腹腔注射鹽酸ADR，劑量分別為1，1.5，2，2.5mg/kg，每個劑量給藥2次，共8次，累計劑量14mg/kg，隔日1次，持續(xù)16d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 Western Blot方法測定：JP2的蛋白表達(dá)參照文獻(xiàn)［3-4］將樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，蛋白質(zhì)采用濕電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉液封閉（室溫，1h），棄去封閉液。按約0.1mL/cm2的量加入封閉液和適量一抗junctophilin2抗體（abcam公司，ab110056）、β-actin（abcam公司，ab8227）抗體（1∶4000）。將膜與HRP結(jié)合的二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，二抗用封閉液1：5000稀釋）室溫下?lián)u蕩孵育用PBST充分洗膜，漂洗5次，每次5min。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，顯影定影，對膠片灰度掃描。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析軟件對Western blot雜交條帶進(jìn)行掃描，以JP2蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示組織中JP2蛋白表達(dá)水平。

1.5 指標(biāo)的檢測 血清中NE、ET-1測定：灌胃給藥第17日，頸總動脈取血3000r/min，離心10min，取血清，采用Elisa法測定血清中NE、ET-1的含量。心臟組織中Na+-K+-ATPase活性測定：稱取心臟，制成10％的組織勻漿，2500r/min，離心10min，取上清，采用Elisa法測定心臟組織勻漿中Na+-K+-ATPase的活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附子干姜配伍對心衰大鼠血漿中NE和ET-1、心臟組織中Na+-K+-ATPase含量的影響 見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，附子干姜（1∶1）高劑量組NE含量顯著降低，附子高劑量組，附子干姜（1∶1）高及低劑量組ET-1的含量顯著降低，心臟組織中Na+-K+-ATPase附子高劑量組，附子干姜（1∶1）高、低劑量組顯著升高，其中附子干姜（1∶1）高劑量組變化更為顯著（均P＜0.05或P＜0.01）。

表1 附子干姜對心衰大鼠心臟組織中Na+-K+-ATPase和血清NE、ET含量影響（±s）

表1 附子干姜對心衰大鼠心臟組織中Na+-K+-ATPase和血清NE、ET含量影響（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

分組 n對照組 10模型組 10附子高劑量組 10 Na+-K+-ATPase（U/mgprot）NE（ng/L）ET-1（ng/L）0.81±0.15** 73.28±10.43*39.86±3.23**0.34±0.09 87.84±3.14 51.17±2.96 0.45±0.07* 80.63±8.63 43.21±5.12*附子低劑量組 10 0.43±0.08 83.55±7.90 44.92±5.45附子干姜（1∶1）高劑量組 10 0.68±0.10** 76.10±8.34*43.28±3.12**附子干姜（1∶1）低劑量組 10 0.50±0.09* 79.40±9.51 45.40±3.29*

2.2 附子干姜配伍對心衰大鼠心臟組織中JP2蛋白表達(dá)的影響 見表2。與模型組相比，附子高劑量組，附子干姜（1∶1）高、低劑量組大鼠心臟組織中JP2的蛋白表達(dá)都有所上調(diào)，其中附子干姜（1∶1）高劑量組JP2的蛋白表達(dá)上調(diào)更顯著（P＜0.01）。

表2 附子干姜對心衰大鼠心臟組織中JP2蛋白表達(dá)影響（±s）

表2 附子干姜對心衰大鼠心臟組織中JP2蛋白表達(dá)影響（±s）

分組 n對照組 10模型組 10附子高劑量組 10 Junctophilin-2（JP2）蛋白表達(dá)1.04±0.03**0.22±0.04 0.58±0.13*附子低劑量組 10 0.42±0.11附子干姜（1∶1）高劑量組 10 0.66±0.05**附子干姜（1∶1）低劑量組 10 0.51±0.09*

3 討論

心力衰竭時心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的NE再攝取功能遇到障礙，細(xì)胞外間隙NE的長期慢性持續(xù)性蓄積，導(dǎo)致腎上腺素能受體過度激活，并誘導(dǎo)心肌肥厚和心室重構(gòu)［5］。ET-1是機(jī)體內(nèi)一種強(qiáng)烈的縮血管物質(zhì)，由血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等分泌產(chǎn)生。ET-1可促進(jìn)心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成和釋放AngⅡ，并可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成。研究發(fā)現(xiàn)，慢性心衰可伴有ET-1水平的增高［6］。綜上所述在慢性心衰發(fā)生時，NE和ET-1含量都是有所升高，可以看作它的一種判定指標(biāo)。

圖1 附子干姜對心力衰竭大鼠JP2蛋白表達(dá)的影響

Na+-K+-ATPase廣泛分布于細(xì)胞膜上，在CHF的病理生理過程中，Ca2+調(diào)節(jié)的改變是各種機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase的蛋白水平和活化程度是細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。經(jīng)研究表明，CHF時Na+-K+-ATPase活性降低，細(xì)胞內(nèi)Na+升高，Na+-K+交換增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，ATP生成減少，依靠能量的質(zhì)膜及肌漿膜Ca2+-ATPase因能量不足不能將肌漿過多的Ca2+泵出或攝入肌漿網(wǎng)，致使心肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣超載［7］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，附子、附子干姜（1∶1）配伍組Na+-K+-ATPase活性都有所增加，其中附子干姜（1∶1）高劑量組活性增加更明顯，這為附子干姜配伍產(chǎn)生的強(qiáng)心作用比附子的更顯著提供了理論依據(jù)。附子干姜配伍的強(qiáng)心作用可能與心臟組織中Na+-K+-ATPase活性變化有關(guān)。

Junctophilin蛋白是維持細(xì)胞膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)（ER/SR）膜聯(lián)接復(fù)合物的關(guān)鍵分子。研究表明，JP2通過N端附近的重復(fù)MORN結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜相互聯(lián)結(jié)，并通過C端錨定于肌質(zhì)網(wǎng)［8］，JP2是維持二聯(lián)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，對維持鈣致鈣釋放分子耦聯(lián)效率起著至關(guān)重要的作用［9］。在心肌肥厚和心力衰竭過程中，JP2的表達(dá)水平顯著降低，并且二聯(lián)體結(jié)構(gòu)受到損害［10］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，附子、附子干姜（1∶1）各劑量組大鼠心臟組織中JP2蛋白表達(dá)上調(diào)，其中附子干姜（1∶1）高劑量組大JP2蛋白表達(dá)上調(diào)更顯著，其強(qiáng)心機(jī)理可能與JP2蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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Study on the Compatibility of Aconite and Dried Ginger Treating Rats with Adriamycin-induced Chronic Heart Failure

LIANG Tao，GEN Shan，ZHOU Lingling，et al.
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China

Objective：To study the compatibility of aconite and dried ginger treating rats with adriamycin-induced chronic heart failure and to explore its mechanism.Methods：Hydrochloride adriamycin injection was applied to establish an chronic heart failure animal model.SD rats were randomly divided into 6 groups：normal group，model group，aconite high and low dose groups（3.3，1.65g/kg），and aconite and dried ginger（1∶1）high and low dose groups（6.7，3.3g/kg）.The content of NE and ET-1 in rat serum and activity of Na+-K+-ATPase in cardiac tissue were detected by ELISA.JP2 protein expression in heart tissue was detected by western blot.Results：Compared with model group，the levels of NE and ET-1 in serum significantly decreased while the activity of Na+-K+-ATPase and expression of Junctophilin-2（JP2）protein in cardiac tissue significantly increased.Compatibility of aconite and dried ginger（1∶1）had more significant effect on the high dose group.Conclusion：Compatibility of aconite and dried ginger treating adriamycin-induced chronic heart failure may relate to increasing activity of Na+-K+-ATPase and enhancing expression of Junctophilin-2（JP2）protein.

Aconite；Dried ginger；Adriamycin；Heart failure

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1821-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.018

2014-07-02）

南京中醫(yī)藥大學(xué)國家基金預(yù)研基金科研課題（12XYY08）