穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化不穩定斑塊HSP70表達的影響*

顏曉睿 宮麗鴻

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化不穩定斑塊HSP70表達的影響*

顏曉睿1宮麗鴻2△

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

目的 觀察搜風祛痰法中藥復方穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化（AS）不穩定斑塊HSP70表達的影響。方法 ApoE基因敲除小鼠高質飲食喂養13周后，待其形成成熟的AS斑塊，隨機分為模型組、穩斑湯低劑量組、穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量組、西藥組、空白對照組。各組相應處理13周后，取主動脈組織HE染色后在光學顯微鏡下進行病理學觀察，然后采用免疫組化和RT-PCR技術檢測HSP70的表達水平。結果 治療組主動脈組織中HSP70表達水平高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），穩斑湯高劑量組HSP70表達水平與西藥組無明顯差異（P＞0.05）。結論 捜風祛痰中藥復方穩斑湯可通過影響HSP70以穩定易損斑塊，其機制可能與HSP70對心血管系統的保護作用相關。

搜風祛痰法 復方穩斑湯 ApoE基因敲除小鼠 動脈粥樣硬化不穩定斑塊 HSP70

近年來，由心血管事件引發的死亡率已超過感染性疾病躍居第一位，預計到2020年，每年將有2.5億人患有心血管疾病，而其中1/3的人將死于急性冠脈綜合征（ACS）［1］。研究表明，炎癥啟動灌裝動脈粥樣硬化的發生并影響其進程，使AS斑塊變得不穩定，引起ACS。斑塊內炎癥反應、全身性炎癥反應以及感染均可影響斑塊的穩定性［2］。熱休克蛋白（HSP），也稱應激蛋白，是一類在結構上高度保守的蛋白，廣泛存在于原核生物和真核生物中［3］。研究發現，HSP70無論在正常還是在應激情況下，對細胞的蛋白合成均發揮重要作用，尤其在心肌缺血過程中，不僅是細胞受損的標志，也是細胞的保護因子。HSP70在細胞內過量表達對一定時間內的嚴重心肌缺血有保護作用［4］。本研究旨在觀察捜風祛痰中藥復方穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化不穩定斑塊內HSP70表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡ApoE基因缺陷鼠（系C57BL/6J，北京大學實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功）70只，SPF級，體質量18～20g。

1.2 藥物與試劑 藥物為穩斑湯，組成為全蝎5g，蜈蚣2g，地龍15g，陳皮15g，半夏15g，白術15g，水蛭15g。由遼寧中醫藥大學附屬醫院提供，加工制成含生藥2g/mL的中藥濃縮液備用。相關抗體（北京博奧森生物科技有限公司）。SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.3 實驗方法 （1）造模。小鼠予高脂飼料喂養13周后，隨機處死4只，取主動脈根部，HE染色觀察AS硬化程度，確定造模成功。（2）分組及中藥干預。ApoE基因敲除小鼠60只隨機分為5組每組12只：模型組、穩斑湯低劑量組、穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量組及西藥組。根據成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質量折算系數9.0折算成小鼠用量，穩斑湯低劑量組：61.75g/（kg·d），穩斑湯中劑量組123.5g/（kg·d），穩斑湯高劑量組247g/（kg·d），西藥組0.27g/（kg·d），模型組給予0.9％氯化鈉注射液0.3mL/d。按體質量系數比折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次。正常C57BL/6J小鼠12只正常飼料喂養13周，設為空白對照組。 取材前夜禁食，經小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存，用作測定血清HSP70水平。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10％甲醛固定，主動脈放在凍存管內液氮驟冷保存。

1.4 檢測方法 （1）主動脈組織病理學觀察。每組隨機取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下在每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面，分別為：①升主動脈最近端橫截面，切面形態呈圓形；②主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；③主動脈瓣起始橫截面；④主動脈瓣完全出現并匯合在一起，0.9％氯化鈉注射液沖洗，10％甲醛中性溶液固定。常規石蠟包埋，均勻間斷切片，厚5μm。HE染色，普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態結構；Masson染色，普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。用計算機彩色圖像處理系統測量血管內膜厚度，斑塊面積，管腔面積，脂質核心面積，斑塊中除膠原和纖維成分以外的斑塊面積，最小纖維帽厚度。（2）免疫組織化學檢測。采用SP法，常規滴加一抗，二抗，DAB顯色蘇木精復染，高倍視野下計數浸潤于內膜的單核細胞數。以染色系數統計HSP70免疫組化染色結果。（3）實時定量RT-PCR檢測。先提取總RNA，然后取4μL總RNA經反轉錄酶及隨機引物等反應物混合配成20μL體系，42℃15min，95℃，2min反轉錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR反應，分別對小鼠HSP70的表達進行測定。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件分析。計量資料數據以（±s）表示。組間比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學改變 各組小鼠主動脈HE染色形態學改變如下。空白對照組：動脈內膜附有一層內皮細胞，內皮細胞層呈現皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞（圖1A）。模型組：血管腔內可見明顯的粥樣硬化斑塊出現，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細胞、彈力纖維和膠原組織構成，斑塊中央可見大量的脂質聚集，斑塊內可見大量泡沫細胞，偶見炎性細胞浸潤。未出現斑塊的動脈內膜區域嚴重破損（圖1B）。穩斑湯低劑量組：血管腔內可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內脂質含量較模型組少，斑塊內可見少量泡沫細胞及炎性細胞。未出現斑塊的動脈內膜區域形態較為完整，偶見內膜殘缺（圖1C）。穩斑湯中劑量組（圖1D）、穩斑湯高劑量（圖1E）、西藥組（圖1F）：動脈內膜大部分較為光滑，偶見內膜不全，內膜不全區域可見明顯的脂質條紋塊形成，偶見泡沫細胞聚集，有少量纖維成分交聯（見圖1）。

圖1 光鏡下各組小鼠腹主動脈根部組織及斑塊的形態結構改變（HE染色，×100）

2.2 免疫組化 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70主要表達于細胞漿中，陽性表達產物呈棕褐色顆粒，粥樣硬化斑塊中主要表達于纖維帽的平滑肌細胞胞漿中。空白對照組小鼠動脈內膜細胞胞漿內可見大量陽性表達顆粒（見圖2A），模型組小鼠動脈組織切片中陽性表達物明顯減少（見圖2B），各治療組表達水平高于模型組（見圖2）。

圖2 高倍視野下以染色系數統計HSP70免疫組化染色結果（DAB顯色，×100）

2.3 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70表達水平 見表1、表2、圖3。給藥13周后，在斑塊內HSP70表達水平方面，穩斑湯各劑量組與西藥組較模型組明顯增高（P＜0.05），與空白對照組比較明顯增高（P＜0.01），穩斑湯高劑量組與西藥組較模型組明顯增高（P＜0.01），穩斑湯高劑量組與西藥組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白表達水平（±s）

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白表達水平（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n空白對照組 10模型組 10穩斑湯中藥低劑量組 10 HSP70表達水平0.201±0.013 0.169±0.009*0.210±0.011*穩斑湯中藥中劑量組 10 0.219±0.014*△穩斑湯中藥高劑量組 10 0.246±0.006*△△西藥組 10 0.242±0.015*△△

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達水平（±s）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達水平（±s）

組 別 n空白對照組 10模型組 10穩斑湯中藥低劑量組 10 HSP70 mRNA表達水平0.291±0.030 0.233±0.028*0.285±0.028△穩斑湯中藥中劑量組 10 0.343±0.020*△穩斑湯中藥高劑量組 10 0.382±0.012*△西藥組 10 0.413±0.021*△

圖3 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達電泳圖

3 討論

AS是一個復雜的病理進展過程，其發病機制至今尚未完全明了，目前多認為AS是一個炎癥過程［5］，與內皮細胞受損、平滑肌細胞增殖［6］、炎癥細胞浸潤等因素密切相關。局部炎癥細胞的浸潤以及全身性炎癥是導致易損斑塊潰瘍、破裂導致血栓形成，是臨床ACS的主要病理學基礎［7］。而斑塊破裂是導致ACS的主要原因，因此穩定易損斑塊為當今醫學領域的研究重點。

HSP70是主要的伴侶蛋白，發揮“分子伴侶”作用，促進新生多肽鏈的正常折疊，協助新生蛋白質的合成和修復損傷的蛋白質，維持蛋白質合理構象；對分子重排、蛋白質集聚和新生多肽的跨膜轉運具有輔助作用，減少細胞凋亡，修復離子通道；激活某些酶的作用以保護細胞的生成與功能［3］，對心肌細胞有強大的保護作用。

ACS屬中醫學“胸痹”、“真心痛”的范疇，為本虛標實之證，本虛多為氣虛，標實則為血瘀、痰濁。痰瘀互結，日久蘊熱，熱極生風相互促生，日久不化，釀成濁脂，浸于脈管，誘發機體炎癥反應，使AS形成不斷增大甚至破裂；痰為百病之崇，風為百病之長，善行而數變，故發為不穩定型心絞痛或心肌梗死，因此可應用搜風祛痰中藥穩定粥樣硬化斑塊。藥理研究顯示，全蝎能夠增強心肌收縮力、擴張血管、降低血壓、抗血栓形成；蜈蚣能抗心肌缺血、擴張血管、增強心肌收縮力；地龍能激活纖溶酶原；陳皮能抑制血小板聚集，降低血脂，降低血液高凝狀態，預防動脈粥樣硬化；水蛭能抗血栓形成，降低血液黏稠度，調血脂，防止動脈粥樣硬化，而實驗結果表明穩斑湯能明顯提高HSP70的表達，從而保護心血管系統并穩定易損斑塊。

綜上所述，穩斑湯在臨床推薦劑量上可通過影響HSP70的表達來穩定易損斑塊，其機制與HSP70對心血管系統的保護作用有關，且療效與西藥阿托伐他汀無明顯差異，毒副作用較小，具有一定的經濟價值和社會價值。

［1］Geneva.World Health Report 2002：Reducing risks，promot-ing healthy life［J］.World Health Organization，2002，35（2）：87.

［2］周明學，徐浩，潘琳，等.活血、益氣、化痰中藥對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應的影響［J］.中國中醫急癥，2008，17（4）：496-498.

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［4］李萍，富青，熊凡.熱休克蛋白70及其在心肌保護中的作用［J］.醫學綜述，2004，10（2）：94-96.

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［6］陳紀林.防治動脈粥樣硬化的新動向［J］.中國循環雜志，2001，16：163-166.

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Effect of Stablizing Plaque Decoction on Unstable Plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）Expression of ApoE Knockout Rats with AS

YAN Xiaorui，GONG Lihong.
Liaoning Traditional Chinese Medical University，Liaoning，Shengyang 110032，China

Objective：To explore the effect of compound stablizing plaque decoction on unstable plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）expression of ApoE knockout rats with AS.Methods：70 ApoE knockout mice were fed a high-fat diet for 13 weeks until the mature atherosclerotic plaques were formed.Thereafter，they were randomly divided into the model group，low-dose，medium-dose，high-dose of stabilizing plaque decoction groups，western medicine control group，and normal group.After 13 weeks，aortic tissues of each group were fetched to observe under an optical microscope after HE staining.And then immunohistochemical methods and RT-PCR technique were used to detect the level of HSP70 expression.Results：The HSP70 expression levels in aortic tissue of mice in the treatment groups were higher than control group（P＜0.05或P＜0.01），and the expression levels of HSP70 between TCM high-dose group and western medicine group had no significant differences（P＞0.05）.Conclusion：Searching wind and eliminating phlegm compound stabilizing plaque decoction may stabilize plaques by influencing the HSP70，and its mechanism may be associated with its protection for the cardiovascular system.

Searching wind and eliminating phlegm method；Compound stabilizing plaque decoction；ApoE knockout mice；AS unstable plaque；HSP70

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1782-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.004

2014-06-21）

中國博士后面上項目（No.20110491540）；遼寧省百千萬人才項目（No.2011921022）

△通信作者