c-FLIP在惡性血液病中的表達及其臨床相關性研究

宋 敏，王建寧，孟慶齊，包紅雨，陸 化

（1.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；

2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210029）

c-FLIP在惡性血液病中的表達及其臨床相關性研究

宋 敏1，王建寧1，孟慶齊1，包紅雨1，陸 化2

（1.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；

2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210029）

目的探討c-FLIP基因在血液腫瘤中的表達以及臨床意義。方法以半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測22例血液腫瘤骨髓中的c-FLIP mRNA表達，Western-Blot蛋白質(zhì)印跡(WB)方法檢測其c-FLIP蛋白的表達。病例包括急性白血病(AL)12例(其中初治11例及反復復發(fā)1例)、完全緩解(CR)后AL 2例、慢性粒細胞性白血病(CML)2例、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)2例、多發(fā)性骨髓瘤(MM)2例和骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴原始細胞增多2型(MDS-RAEB-2)2例。結果初治和復發(fā)AL，初治CML、CLL、MDS-RAEB-2、MM患者c-FLIP mRNA和蛋白均表達異常增高。初治AL c-FLIP mRNA及43 kD蛋白的表達顯著高于慢性白血病(CL)(P＜0.05)。MDS-RAEB-2、MM與ALc-FLIP mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但MDS 55 KD、43 KD蛋白表達明顯低于AL(P＜0.05)，而MM無明顯差異。對照組mRNA及其蛋白均陰性表達，CR后AL mRNA陰性表達，但其蛋白均有表達，低表達于AL，尤其43 kD明顯低于AL(P＜0.05)。c-FLIP表達在初治AL患者與其年齡、性別、初診白細胞數(shù)、LDH以及核型、免疫表型無關。AL患者c-FLIP mRNA及其蛋白表達與初治療效無明顯相關性(P＞0.05)。結論血液腫瘤患者c-FLIP mRNA及其蛋白表達異常增高，能夠反映出惡性血液病患者骨髓造血細胞的凋亡抑制情況，與惡性血液病的類型、疾病的狀態(tài)以及病程中的臨床療效、預后等都密切相關。

c-FLIP；惡性血液病；RT-PCR；Western blot

惡性血液病是一類難治性血液系統(tǒng)腫瘤，治療棘手，生存期短，預后差，具體發(fā)病機制至今尚未明了。凋亡異常是惡性血液病發(fā)病和耐藥的重要機制之一。對白血病及其他腫瘤細胞凋亡機制的研究和探索有利于幫助該類患者改善臨床緩解率、克服耐藥及改善預后[1]。細胞型Fas相關死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白(c-FLIP)為新發(fā)現(xiàn)的直接作用于Caspase介導的凋亡途徑終極部位的凋亡抑制蛋白，它含有兩個連續(xù)的N端死亡效應域(DED)，其后包含一個由C端延伸的Caspase結構類似區(qū)域，但無蛋白水解酶的活性，而可以競爭的結合于含死亡結構域(DD)Fas相關蛋白(FADD)或者Caspase-8的DED，進一步的阻斷了死亡誘導信號復合體(DISC)形成；強效的抑制死亡受體(DR)——Fas、TRAIL(腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體)-R、TNFR1(腫瘤壞死因子的受體)誘導下的細胞調(diào)亡。

本研究使用RT-PCR檢測22例血液惡性腫瘤患者骨髓單個核細胞的c-FLIP的mRNA表達，以及采用Western-Blot方法檢測其c-FLIP蛋白表達水平，同時分析了c-FLIP mRNA與蛋白表達的相關性，及不同分子量的c-FLIP蛋白在不同患者中的表達情況。對惡性血液病患者體內(nèi)細胞凋亡的激活狀態(tài)進行了初步的探索，并探討了c-FLIP基因與血液惡性腫瘤的不同類型、疾病的不同狀態(tài)和臨床療效及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 急性白血病(AL)12例，其中初治急性非淋巴細胞白血病(ANLL)7例(1例M1，2例M2，2例M3，2例M5)，初治急性淋巴細胞白血病(ALL)3例(1例伴ph+，1例伴髓系表達)，1例初治急性混合細胞白血病，1例反復復發(fā)M1，2例完全緩解(CR)后M2，2例初治慢性粒細胞性白血病(CML)，2例初治慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)初治患者2例，骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴原始細胞增多2型(MDS-RAEB-2)初治患者2例。骨髓標本來自于2006年10月至12月的住院和門診患者，其中男性15例，女性7例，年齡16～71歲(平均47歲)。同時采用2例同期輕度白細胞數(shù)減少，骨髓象正常的患者作為正常對照組。以張之南主編的《血液病診斷及療效標準》作為急性白血病的診斷標準參照及白血病完全緩解標準參照。

1.2 方法

1.2.1 骨髓標本的采集方法和單個核細胞(MNC)分離 以無菌操作抽取22例惡性血液病患者和2例對照者的抗凝骨髓4 ml，加入等量PBS稀釋后以淋巴細胞分離液分離出骨髓的MNC，PBS洗滌兩次后在光學顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整MNC的濃度至3×106個，采用常規(guī)凍存的方法將標本放于-70℃凍存以備用。

1.2.2 RT-PCR 將凍存細胞復蘇以后，以PBS液洗滌3次，以Trizol Reagent(美國Invitrogen公司)提取細胞中的總RNA，生物分光光度計(德國，Eppendorf公司)測定其D260/D280值均在1.8～2.0，在瓊脂糖變性凝膠電泳上見28S和18S條帶，證明細胞標本中的RNA無降解。以25 μl的反應體系(美國，Promega公司)，其中包含有2 μg總RNA，2 μl的Oligo(dT) (0.5 μg/μl)，5 μl的5×RT Buffer，2.5 μl的dNTP mix，3 μl的AMV Reverse Transcriptase，1 μl的Rnasin Ribomuclease Inhibitor(10 U/μl)。在42℃水浴中1 h，在95℃時終止其反應5 min，所得的cDNA在-20℃保存以備用。在50 μl的反應體系里包含2 μl的cDNA，5 μl的10×Buffer，1 μl(0.2 mmol/L)的dNTP mix，一對各1.25 μl引物，0.5 μl的Tag酶(5U/μl)，3 μl的MgCl2(1.5 mmol/L)；在95℃時預變性5 min、94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，共35個循環(huán)。在72℃延伸5 min。取其擴增產(chǎn)物5 μl在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min(電壓為110 V，0.5×TBE為緩沖液)。以凝膠成像分析系統(tǒng)(美國，Cold Spring)進行信號的掃描，用Quantity One4.5.2軟件(美國，Bio Rad)定量分析。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參。半定量分析擴增條帶以目的條帶/內(nèi)參輝度值作為實驗結果的觀測指標。

1.2.3 Western Blot蛋白質(zhì)印跡 采集好的細胞標本在復蘇后用PBS洗滌3次，按照蛋白抽提試劑盒所提供操作步驟來提取出標本的總蛋白并測定蛋白的濃度。蛋白上樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，使用電轉儀(美國，Bio Rad公司)，把蛋白轉移到PVDF膜(美國，Bio Rad公司)上，在轉膜結束后用脫脂奶粉溶液封閉過夜，與兔抗FLIP多抗(R&D公司)在室溫下孵育1 h，以辣根過氧化物酶標記羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫孵育1 h，最后用ECL化學發(fā)光(PIERCE公司)，X光片曝光后顯影、定影。通過成像軟件Quantity One 4.5.2，與Beta.actin對比后進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，兩樣本均數(shù)比較使用成組設計t檢驗，兩兩比較方法采用Scheffe法。相關性分析采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 c-FLIP基因的mRNA和c-FLIP基因的蛋白在血液腫瘤患者中的表達 血液腫瘤患者骨髓的單個核細胞中c-FLIP基因的mRNA及其蛋白均檢測出表達的異常增高。Western印跡檢測結果顯示所有惡性血液病患者骨髓核細胞中，均呈現(xiàn)c-FLIP蛋白表達(圖1)，所有患者均表達c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIPL(43 kD)、c-FLIPS(26 kD)、p33-FLIPL(33 kD)、p22-FLIPL(22 kD)等。

圖1 惡性血液病患者cFLIP基因的蛋白表達

2例正常對照者mRNA及其蛋白均陰性表達。2例治療完全緩解后AL患者mRNA的表達為陰性，但其c-FLIP蛋白均有表達，但低于12例(初治+復發(fā))AL的c-FLIP表達，同時兩者之間的43 kD表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達見表1。初治ANLL和初治ALL的c-FLIP mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，但55 kD的表達ALL顯著高于ANLL，43 kD蛋白表達無明顯差異。其中1例急性混合細胞白血病：55 kD：0.49；43 kD，0.62；mRNA，0.89。1例反復復發(fā)并且多種化療藥物耐藥的M1患者c-FLIP基因的mRNA表達(0.99)明顯增高，蛋白表達亦明顯增高，55 kD：2.0；43 kD：1.9。AL c-FLIP mRNA及其43 kD蛋白的表達顯著高于慢性白血病(CL)，55 kD蛋白的表達亦高于CL，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。其中2例CML蛋白55 kD表達(0.50±0.00)、43 kD(0.50±0.01，P=2)均低表達于12例AL，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；但CMLmRNA表達(0.43±0.01)，顯著低于AL的表達(P＜0.05)。2例CLL蛋白55 kD表達(0.90±0.14)、43 kD表達(0.48±0.11，n=2)、mRNA表達(0.80±0.04)均低表達于AL，尤其43 kD蛋白的表達，但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；2例CLL的55 kD蛋白(0.90±0.14)的表達亦高于2例CML(0.50±0.00)。2例MM蛋白55 kD表達(0.45±0.07)、43 kD(0.45±0.07，n=2)、mRNA表達(0.73±0.15)均低表達于AL，尤其是蛋白的表達，但由于病例少，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2例MDS者55 kD表達(0.20±0.00)、43 kD(0.20±0.00，n=2)均明顯低于AL的表達(P＜0.05)，而其mRNA表達(0.83±0.04)，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達()

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達()

55 kD檢驗值P值43 kD檢驗值P值mRNA檢驗值P值0.81±0.25 -2.76 0.025 0.91±0.18 0.53 0.61 0.89±0.30 -0.54 0.61 1.38±0.41 -2.76 0.025 0.84±0.23 0.53 0.61 0.99±0.23 -0.54 0.61 1.03±0.49 1.54 0.15 0.95±0.35 3.03 0.01 0.92±0.25 5.05 0.00 0.48±0.35 1.54 0.15 0.18±0.04 3.03 0.01 0.00 5.05 0.00 1.03±0.49 1.56 0.14 0.95±0.35 3.17 0.01 0.92±0.25 2.62 0.018 0.69±0.23 1.56 0.14 0.49±0.05 3.17 0.01 0.61±0.20 2.62 0.018

2.2 c-FLIP基因的表達與急性白血病患者臨床特征的相關性 分析c-FLIP基因mRNA及c-FLIP基因蛋白的表達與初治急性白血病患者的年齡、性別、初診時的白細胞計數(shù)、LDH及核型的相關性，發(fā)現(xiàn)其差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。但其中多種染色體異常的患者[除去僅有t(15；17)者]55 kD蛋白表達高于正常染色體者(P＜0.05)，病例數(shù)尚需累積。

2.3 c-FLIP基因的表達與初發(fā)急性白血病的免疫表型的關系 用流式細胞術來檢測白血病細胞的CD13、CD33、CD34、HLA-DR的表達。實驗結果顯示CD13、CD33陽性組55 kD、45 kD、mRNA表達分別為(0.92±0.56)、(0.77±0.22)、(0.77±0.22)(n=9)；CD13、CD33陰性組分別為(0.88±0.34)、(0.78±0.37)、(0.88±0.37，n=2)，表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD34、HLA-DR陽性組55 kD、45 kD、mRNA表達分別為(0.93±0.26)、(0.78±0.43)、(0.94±0.33，n=8)；陰性組分別為[(0.89±0.38)、(0.77±0.27)、(0.76±0.32)，n=3]，表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD13陽性的表達組和CD33陽性的表達組其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.4 c-FLIP基因的表達與急性白血病的首次治療療效的關系 2例初治的M3患者均完全緩解(CR)，其余9例初治AL中1例治療相關性死亡，1例ALL(伴髓系表達)沒有治療，其總的CR率為66.67% (6/9)。初發(fā)的AL首次化療以后未能達到CR(NR)者c-FLIP基因的mRNA表達[(0.91±0.03)，n=3]高于達到CR的患者[(0.67±0.21)，n=4]，但其差異無統(tǒng)計學意義(P=0.23)，與我們既往研究一致。55 kD蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，NR者[(0.92±0.61)，n=3]；CR者[(0.83±0.28)，n=4]；43 KD蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，NR者[(0.56±0.08)，n=3]；CR者[(0.70±0.26)，n=4]。1例急性混合細胞白血病為治療相關死亡mRNA表達0.89，但蛋白表達55 kD：0.49；45 kD：0.62，卻無明顯的蛋白表達增高。1例急性淋巴細胞白血病伴ph+者mRNA表達0.93，但蛋白表達55 kD：1.35；45 kD：0.58，55 kD表達亦明顯增高，患者臨床治療未達緩解，最終死亡。1例反復復發(fā)并且多種化療藥物耐藥M1患者c-FLIP基因的mRNA表達(0.99)明顯升高，蛋白表達亦明顯增高，55 kD：2；45 kD：1.9，且反復治療未能達CR，最終死亡。

表2 c-FLIP基因表達與初治急性白血病臨床特征的關系()

表2 c-FLIP基因表達與初治急性白血病臨床特征的關系()

年齡(歲)≥18＜18檢驗值P值性別1.04±0.54 0.99±0.00 0.11 0.91 0.95±0.39 0.95±0.00 0.01 0.99 0.93±0.27 0.88±0.11 0.28 0.78男女檢驗值P值白細胞數(shù)(×109/L)≥50＜50檢驗值P值乳酸脫氫酶(U/L)≥600＜600檢驗值P值核型正常其他[除外t(15;17)]檢驗值P值9 2 5 6 3 8 5 6 4 5 1.16±0.54 0.85±0.40 1.08 0.31 1.04±0.42 0.83±0.21 1.03 0.33 0.90±0.28 0.95±0.23 -0.31 0.76 0.92±0.48 0.94±0.43 -0.08 0.94 0.67±0.29 0.86±0.20 -1.16 0.28 1.02±0.29 0.89±0.28 0.68 0.52 0.84±0.25 1.03±0.56 -0.69 0.51 0.87±0.24 0.73±0.22 0.96 0.36 0.97±0.28 0.90±0.30 0.42 0.69 0.60±0.27 1.03±0.21 -2.56 0.043 0.76±0.22 0.88±0.20 -0.80 0.45 0.87±0.38 0.95±0.19 -0.37 0.72

2.5 c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表達相關性分析 分析12例AL患者c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表達相關性分析：c-FLIP 55 kD蛋白的表達與其mRNA表達無明顯相關性(r=0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表達與其mRNA表達無明顯相關性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表達存在相關性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。其中ANLL、ALL患者的c-FLIP 55 kD、43 kD蛋白表達與其mRNA亦無明顯相關性(P＞0.05)。

3 討論

c-FLIP是一種新近發(fā)現(xiàn)的直接作用于Caspase環(huán)節(jié)的凋亡抑制蛋白，由Irmler等[2]1997年首先在研究惡性黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)。c-FLIP基因定位在人類染色體的2q33，它的mRNA的表達形式有多種的拼接亞型，但目前研究顯示其在體內(nèi)表達的蛋白形式僅有FLIPL、FLIPS、FLIPR三種亞型。FLIPL的相對分子質(zhì)量為55 kD，F(xiàn)LIPS為26 kD。研究表明，這兩種亞型均能顯著的抑制FAS介導的細胞凋亡[3]。FLIPR是新發(fā)現(xiàn)的分子量更小的而其功能類似于FLIPS的表達蛋白[4]。在Fas介導的死亡信號轉導通路中，隨著Fas的刺激，DISC的形成，proCaspase-8與DISC的結合后，首先裂解產(chǎn)生p43/p41和p12兩個亞單位；然后列解成為活性酶亞單位p18和p10，并產(chǎn)生p26/p24原結構域。最后以形成的活性的Caspase-8異四倍體(p102-p182)形式釋放入細胞漿而傳導細胞的凋亡信號。活性Caspase-8直接導致下游的效應分子proCaspase-3, 7,9的活化，并裂解下游效應Caspases[5]。c-FLIP因其結構與Caspase-8/10的相似性，而競爭性的強效的抑制了Caspase介導的凋亡。

FLIP除了通過與DISC的綁定而發(fā)揮其抑制凋亡外，Thome等[6]研究中發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號轉導途徑中，高濃度c-FLIPL亦能激活NF-κB[7]。Kataoka等[8]研究揭示，由c-FLIPL介導的NF-κB活化需要p43-FLIP片斷的參與。2006年，Golks等[9]研究發(fā)現(xiàn)了新的FLIP片段：p22-FLIP。研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤細胞、成熟樹突狀細胞(DCs)、原始T、B淋巴細胞中，p22-FLIP為激活NF-κB關鍵的中介物，它通過IKKγ亞基與IKK復合物直接綁定，強烈的誘導了NF-κB的激活。該研究揭示了c-FLIP介導的激活NF-κB在淋巴細胞中生存/死亡決策的新機制。研究發(fā)現(xiàn)p43-FLIP和c-FLIPL需要進一步裂解為p22-FLIP以誘導NF-κB活化，提出p22-FLIP是c-FLIP誘導NF-κB活化的最終產(chǎn)物。而體外實驗顯示，活化的成熟的Caspase-8異四聚體p102-p182裂解c-FLIPL產(chǎn)生p12-FLIP和p43-FLIP，而不是p22-FLIP。

文獻顯示c-FLIPL在其發(fā)揮生存/死亡決策的新機制的作用過程中，進一步被裂解為p43-FLIP、p12-FLIP以及p22-FLIP等活性裂解產(chǎn)物和COOH-末端的p33-FLIP等片段，在凋亡、信號轉導途徑中發(fā)揮了其凋亡抑制和調(diào)節(jié)的基本功能。我們本次研究顯示：在惡性血液病患者的骨髓單個核細胞裂解液中存在c-FLIPS(26 kD)、c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIP(43 kD)、p33-FLIP(33 kD)、p22-FLIP(22 kD)等c-FLIP裂解產(chǎn)物，提示在惡性血液病患者體內(nèi)存在著c-FLIP抑制FAS等死亡受體誘導的凋亡，激活NF-κB等抗凋亡途徑而發(fā)揮了其在生存/死亡決策新機制中重要的決定和調(diào)節(jié)的作用。因此，我們希望通過進一步探討惡性血液病患者的c-FLIP表達與臨床特征、治療、預后相關性的分析，為人們在探索治愈惡性血液病的治療學中提供一個新途徑。

惡性血液病因其發(fā)病機制不同，造血細胞的增殖、分化、凋亡的狀況亦有所不同，而決定了其為一大類具有不同臨床表型、臨床特征及病程、不同的治療效果、不同預后的血液系統(tǒng)腫瘤。本次研究采用Western-Blot方法檢測惡性血液病患者c-FLIP基因蛋白表達的結果分析顯示：AL均呈現(xiàn)高表達，AL 43片段表達高于55 kD，只有髓系43 kD片段表達高些，ALL均略弱于AML。2例M3表達小于其他類型者，可能與細胞的成熟度有關。1例混合型AL均強表達，1例反復復發(fā)M1患者均極強表達，高于其他，43 kD表達極強。1例M2 CR仍有55 kD表達，但43 kD以下表達非常弱。2例CLL 55 kD明顯強表達，甚至相近AL，但43 kD以下低表達弱55 kD，且小于AL。CML均低表達，明顯弱于CLL、AL。2例MM均表達，甚則43 kD大于55 kD，顯示其仍與疾病的惡性度有關。2例MDS患者均弱表達，43 kD大于55 kD，顯示其仍與疾病的預后、發(fā)展有關。CLL雖然是形態(tài)上類似成熟淋巴的慢性白血病，但測定中顯示2例CLL 55 kD明顯強表達，甚至相近于AL，但43 kD以下低表達弱于55 kD，且小于AL。所有實驗結果我們?nèi)韵Ｍ龃蟛±龜?shù)檢測數(shù)據(jù)來更好的進行統(tǒng)計分析，有助于幫助評判各片段在惡性血液病中表達的臨床和發(fā)病機制的研究。對于其在臨床診療、預后判斷、治療選擇等方面存在的某種關聯(lián)性亦尚需積累病例數(shù)進一步揭曉。

本次研究的結果提示：正常對照組c-FLIP基因的mRNA和蛋白表達均為陰性。已達CR的AL患者c-FLIP基因的mRNA表達也為陰性，但仍有c-FLIP蛋白表達，明顯低表達于初治AL，尤其是AL已達CR的患者的43 kD蛋白的表達與初治AL比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.01，P＜0.05)。在血液惡性腫瘤患者中，c-FLIP mRNA、蛋白的表達均異常增高，所有初發(fā)、復發(fā)AL患者c-FLIP基因的蛋白均表達增高，復發(fā)患者的c-FLIP基因的蛋白表達也明顯升高，并且預后差，且對多種的化療藥物耐藥，療效差。其中1例多次更換化療方案疾病仍不能好轉，仍呈現(xiàn)高白，其原始細胞高達98%而最終死于出血和感染。本次研究未發(fā)現(xiàn)ANLL中c-FLIP基因的蛋白表達與患者的FAB分型或者患者的免疫表型有著密切的聯(lián)系(P＞0.05)，在一定程度上提示c-FLIP基因的蛋白表達可能與急性非淋巴細胞白血病細胞所處的分化階段并無明顯的關系，但尚需積累更多的病例資料以進一步探索。盡管臨床上患者的首次治療后未能達CR的初發(fā)AL患者c-FLIP基因的mRNA表達高表達于可達到CR患者，但其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，本次研究未顯現(xiàn)c-FLIP蛋白的表達與臨床首次治療的緩解率有關(P＞0.05)。本研究分析AL患者c-FLIP 55 kD蛋白的表達與其mRNA表達無明顯相關性(r= 0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表達與其mRNA表達無明顯相關性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表達存在相關性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。但尚需積累更多病例資料統(tǒng)計，以助進一步分析、揭示c-FLIP基因在惡性血液病患者體內(nèi)轉錄、翻譯、蛋白表達的基本途徑，以期作用于臨床。

既往研究[10]顯示CLL患者c-FLIP mRNA表達明顯高于CML患者，因其疾病的狀態(tài)、疾病的惡性程度不同而低表達于AL。本次研究發(fā)現(xiàn)：CLL的c-FLIP蛋白的表達亦明顯增高，并明顯高于CML，而低于AL(P＞0.05)，尚需累積病例數(shù)。既往研究[10]提示初發(fā)慢性期CML患者的c-FLIP mRNA表達顯著低于初治AL，本次研究發(fā)現(xiàn)，其c-FLIP蛋白表達高于正常對照組，亦低于初發(fā)AL患者，但因病例數(shù)偏少，差異無統(tǒng)計學意義。我們初步可以得出c-FLIP基因的蛋白表達與惡性血液病的類型、疾病當時所處的狀態(tài)和其不同的惡性程度有密切關系。有研究顯示MDS隨著病情的進展，原始細胞的增多，出現(xiàn)了對Fas誘導的凋亡發(fā)生了抵抗的原始細胞組群。本研究中的2例MDS-RAEB-2患者的c-FLIP基因的mRNA表達明顯升高，與AL的cFLIP基因的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但終因其惡性度低于AL患者，其c-FLIP蛋白表達明顯低于AL患者(55 kD，P=0.04，P＜0.05；43 kD，P=0.01，P＜0.05)，顯示c-FLIP的表達與疾病的進程和預后密切相關。2例MM患者c-FLIP基因mRNA和c-FLIP基因的蛋白表達升高，但與AL差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，這也提示其有助于對疾病的狀態(tài)及預后的判斷。因本文收集病例數(shù)偏少，尚需積累更多的臨床資料。

我們的研究顯示：c-FLIP基因是一種重要的惡性血液病相關的凋亡抑制蛋白。c-FLIP基因的表達水平與評價惡性血液病的疾病狀態(tài)、臨床療效、預后有著密切的相關性。檢測血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的c-FLIP基因的表達可以作為評估其病情的發(fā)展和判斷其預后的重要指標。進一步的闡明血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的c-FLIP基因的作用機制也將有助于其基因治療的研究。而惡性血液病骨髓單個核細胞中c-FLIP的不同分子量蛋白的表達在疾病發(fā)病機制中所起的作用的真正途徑尚需進一步積累病例研究。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in hematologic malignancies.

SONG Min1,WANG Jian-ning1, MENG Qing-qi1,BAO Hong-yu1,LU Hua2.1.Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,Jiangsu,CHINA;2.Department of Hematology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore c-FLIP(cellular FLICE inhibitory protein)expression and its clinical significance in hematologic malignancies.MethodsExpression level of c-FLIP mRNA and protein in bone marrow mononuclear cells was determined by Semi-Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(Semi-RT-PCR)and Western blot in 22 patients of hematologic malignancies,which included 11 cases with newly diagnosed acute leukemia(AL),1 case of relapsed AL,2 cases of AL after complete remission(CR),2 cases of chronic myelocytic leukemia (CML),2 cases of chronic lymphocytic leukemia(CLL),2 cases of multiple myeloma(MM)and 2 cases of mycelodysplastic syndrome-refractory anemia with excess blasts-2(MDS-RAEB-2).ResultsExpression level of c-FLIP mRNA and protein were higher in patients with newly diagnosed or relapsed AL and newly diagnosed CML,CLL, MDS-RAEB-2,MM.Levels of c-FLIP mRNAand protein of 43 kD were higher inAL than in newly diagnosed chronic leukemia(CL),P＜0.05.There were no significant differences in mRNA between MDS-RAEB-2,MM and AL(P＞0.05).The levels of c-FLIP protein of 55 kD and 43 kD were lower in MDS than those in newly diagnosed AL(P＜0.05).The expression of normal subjects in mRNA and protein were negative.The expression of AL after CR was negative in mRNA,but positive in protein,and lower than AL,especially in protein of 43 kD(P＜0.05).The expression level of c-FLIP was not associated with age,sex,WBC,LDH,cytogenetic characteristics,immunophenotype(P＞0.05).There were no significant differences in that of curative effect(P＞0.05).Conclusionc-FLIP was highly expressed in hematologic malignancies.The level of expression reflected apoptosis of hematologic malignancies,and was closely related with the type and situation of hematologic malig-nancies,chemotherapeutic effects and prognosis.

c-FLIP;Hematologic malignancies;RT-PCR;Western blot

R552

A

1003—6350（2014）23—3439—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1347

2014-06-17)

南京醫(yī)科大學科技發(fā)展基金重點項目（編號：2010NJMUZ49）

宋 敏。E-mail：songmin218@163.com