大鼠灌胃縮泉方制劑后尿、糞中的益智活性成分及代謝物的測定

秦貞苗，李海龍，譚銀豐，賴偉勇，蔡紅蝶，張小坡，陳 峰

（1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，海南 海口 571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571101）

·論 著·

大鼠灌胃縮泉方制劑后尿、糞中的益智活性成分及代謝物的測定

秦貞苗1，2，李海龍1，2，譚銀豐1，2，賴偉勇1，2，蔡紅蝶2，張小坡1，2，陳 峰1，2

（1.海南省藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，海南 海口 571101；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571101）

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊和縮泉丸后，諾卡酮、益智黃酮(楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)和益智中二芳基庚烷類成分(益智酮甲、益智酮乙、益智醇)在尿和糞中的物質(zhì)形式。方法雄性Sprague Dawley經(jīng)灌胃給予縮泉膠囊(3.54 g/kg)和縮泉丸(3.77 g/kg)后置于代謝鼠籠中，收集12 h的尿液和糞球。糞球稱重后加入9倍體積的去離子水，高速勻漿。分別取100 μl尿液和糞球勻漿液于離心管中，加入300 μl甲醇，漩渦振搖5 min，13 000次/min下離心10 min，取上清液，在N2下吹干，殘渣用50 μl甲醇復(fù)溶，再次振搖和離心，取上清液40 μl，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)進行分析。結(jié)果根據(jù)上述對照品在生物樣品中的LC-MS/MS出峰情況，通過比較空白尿、糞樣品與給藥后相應(yīng)的尿糞樣品，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠灌胃后，在尿液和糞便中主要檢測到原形物質(zhì)形式，未檢測到葡萄糖醛酸結(jié)合物等二相代謝產(chǎn)物。結(jié)論大鼠尿液中檢測到的諾卡酮、益智酮甲以及楊芽黃素等成分，可能是直接作用于膀胱而發(fā)揮調(diào)節(jié)膀胱功能的活性成分。

縮泉丸；縮泉膠囊；排泄；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

尿失禁是常見慢性疾病之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。西藥在臨床使用中占主導(dǎo)地位，縮泉丸是為數(shù)不多的中藥品種之一。本課題組在分析縮泉丸物質(zhì)組成[1]的基礎(chǔ)上先后分析了大鼠灌胃縮泉丸后主要成分在血漿[2-3]以及膽汁[4]中的暴露形式。本文主要探討大鼠灌胃縮泉丸和膠囊后大鼠尿、糞中黃酮類和二芳基庚烷類物質(zhì)的暴露形式。

1 材料與方法

1.1 試藥 楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚標準品由本課題組從益智中分離制備[5]。益智酮甲、益智酮乙和益智醇購自凱方醫(yī)藥科技(上海)有限公司，以上化合物的純度均在98%以上。色譜純級甲醇和乙腈購自美國Tedia公司；色譜級純水由去離子水通過Milipore純水系統(tǒng)制備。其他化學(xué)試劑(分析級或以上級別)購自海南詣高儀器有限公司。縮泉膠囊購自湖南漢森藥業(yè)有限公司(批號110602)，縮泉丸購自廣東華天寶藥業(yè)集團有限公司(批號1110103)。

1.2 實驗動物 雌性Sprague Dawley大鼠，體重200～230 g，購自湖南省長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部。大鼠自由進食和飲水，給藥前夜禁食不禁水。

1.3 供試樣品的制備 取縮泉膠囊去除膠囊殼，將內(nèi)容物合并混合均勻，稱取適量置玻璃研缽中，用0.5%羧甲基纖維素鈉分散均勻后加水適量，制成0.24 g/ml的供試品。縮泉丸研磨粉碎后，同法制備，得到0.25 g/ml的供試品溶液。

1.4 給藥和尿糞樣品收集 動物實驗前1 d進行抓拿適應(yīng)性實驗，置于代謝鼠籠中適應(yīng)1 d，收集空白尿、糞樣品。大鼠分為兩組，經(jīng)灌胃分別給予大鼠縮泉丸(3.77 g/kg)和縮泉膠囊(3.54 g/kg)。給藥后收集12 h內(nèi)尿糞樣品，糞球稱重，樣品置于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 儀器 美國AB公司的AB-SCIEX API 4000 plus串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，通過Turbo V離子源接口與島津公司Prominence UFLC液相色譜儀串聯(lián)。液相色譜儀配制LC-20AD雙泵系統(tǒng)，DGU-20A3R在線脫氣機，SIL-20AHT自動進樣器和CTO-20A柱溫箱。AB-SCIEX軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理。

1.6 尿、糞樣品的處理 糞球樣品加入9倍體積的去離子水，高速勻漿，制備勻漿液。分別取100 μl尿液和糞球勻漿液樣品，加入300 μl甲醇，振搖后放在漩渦振蕩器上震蕩10 min，結(jié)束后將樣品至于離心機中，于13 000次/min下離心10 min，吸取上清液390 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩渦振蕩器上震蕩5 min，再同法離心，吸取40 μl樣品溶液置于樣品瓶的內(nèi)襯管中，供分析用，進樣量10 μl。

1.7 LC-MS/MS分析方法 分析方法請參考本課題組發(fā)表的文獻[4]。簡單的說，采用Phenomenex Kinetex 2.6 μ XB-C18色譜柱(2.10 mm i.d×50 mm)進行樣品的分離分析，溫度控制在40℃。以甲醇-水為流動相(含0.1‰甲酸)，梯度洗脫，正離子模式下多反應(yīng)檢測掃描(MRM)檢測。

2 結(jié)果

2.1 尿、糞樣品中諾卡酮的測定 大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿(保留時間tR為7.30 min)、糞樣(tR為7.26 min)品中均可檢測到諾卡酮的原形物質(zhì)形式(圖1)。

圖1 大鼠尿、糞樣品中諾卡酮的MRM圖譜

2.2 二芳基庚烷類成分及其代謝物的測定 大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿、糞中二芳基庚烷類成分的測定見圖2～圖4，未檢測到益智二芳基庚烷類成分的二相結(jié)合代謝產(chǎn)物。由圖2可知，在大鼠的尿樣品中可檢測到益智酮甲(tR為6.98 min)的原形物質(zhì)形式，但糞中未檢測到。在大鼠的尿樣中未檢測到益智酮乙的原形物質(zhì)(tR為7.23 min)形式，但給藥縮泉膠囊后在糞便樣品(tR為7.21 min)中檢測到少量益智酮乙(圖3)。益智醇(tR為6.96 min)的原形物質(zhì)形式在給藥縮泉膠囊后的尿、糞樣品中可被檢測(圖4)。

圖2 大鼠尿、糞樣品中益智酮甲的MRM圖譜

圖3 大鼠尿、糞樣品中益智酮乙的MRM圖譜

圖4 大鼠尿、糞樣品中益智醇的MRM圖譜

2.3 黃酮類成分及其代謝物的測定 大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿、糞中黃酮類成分的測定見圖5～圖9。未檢測到益智黃酮的二相結(jié)合代謝產(chǎn)物。大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿(tR為7.15 min)、糞(tR為7.11 min)樣品中均可檢測到楊芽黃素的原形物質(zhì)形式(圖5)。在尿樣中檢測不到伊砂黃素，而給藥縮泉膠囊的糞便樣品中，有少量的伊砂黃素原形物質(zhì)(tR為7.36 min)被檢測(圖6)。大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿(tR為6.01 min)、糞(tR為5.98 min)樣品中均可檢測到白楊素的原形物質(zhì)形式(圖7)。大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿(tR為 7.32 min)、糞(tR為7.28 min)樣品中均可檢測到芹菜素-4'，7-二甲醚的原形物質(zhì)形式(圖8)。大鼠灌胃縮泉丸和縮泉膠囊后，大鼠尿(tR為6.28 min)、糞(tR為6.25 min)樣品中檢測不到山奈素的原形物質(zhì)形式(圖9)。

圖5 大鼠尿、糞樣品中楊芽黃素的MRM圖譜

圖6 大鼠尿、糞樣品中伊砂黃素的MRM圖譜

圖7 大鼠尿、糞樣品中白楊素的MRM圖譜

圖8 大鼠尿、糞樣品中芹菜素-4',7-二甲醚的MRM圖譜

圖9 大鼠尿、糞樣品中山奈素的MRM圖譜

3 討論

我們在灌胃給藥縮泉丸和縮泉膠囊后的大鼠血漿中檢測到諾卡酮、益智酮甲、益智酮乙等益智成分的游離藥物形式，但是益智的黃酮類成分以及二芳基庚烷類成分在大鼠體內(nèi)多以二相結(jié)合代謝產(chǎn)物的形式存在[3]。通過本文的研究發(fā)現(xiàn)，所觀察的9個益智活性成分，在尿中可以檢測到諾卡酮、益智酮甲、益智醇、楊芽黃素、白楊素和芹菜素-4'，7-二甲醚原形物質(zhì)形式。這些成分能否在尿液中蓄積到一定的藥物濃度從而作用于膀胱相關(guān)靶標而引起對排尿反射的作用，有待于進一步觀察。在尿液中并未檢測到相關(guān)的二相代謝產(chǎn)物，可能是這些物質(zhì)又發(fā)生了進一步的代謝。

灌胃給藥后，糞便中藥物的來源可能有以下途徑：(1)制劑中未被吸收的部分；(2)吸收后從膽汁中排泄的部分；(3)吸收后腸道分泌的部分；(4)腸道代謝轉(zhuǎn)化的部分。我們在研究益智活性成分的膽汁排泄物質(zhì)形式時發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)在膽汁中主要以二相結(jié)合物的形式存在[3]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的糞便中觀察到諾卡酮、益智酮乙、益智醇、楊芽黃素、白楊素和芹菜素-4'，7-二甲醚的原形物質(zhì)形式，但未檢測到二相結(jié)合代謝產(chǎn)物，說明由膽汁排泄進入腸道中的二相代謝物在腸道菌群的作用下，發(fā)生了降解反應(yīng)。

[1]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation Suoquan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[2]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[3]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Identification of known chemicals and their metabolites from Alpinia oxyphylla fruit extract in rat plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/ MS)with selected reaction monitoring[J].J Pharm Biomed Anal, 2014,97:166-167.

[4]陳 峰,譚銀豐,賴偉勇,等.LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,20(5):581-587.

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Identification of known chemicals and their metabolites from Suoquan formula in rat urine and feces.

QIN Zhen-miao1,2,LI Hai-long1,2,TAN Yin-feng1,2,LAI Wei-yong1,2,CAI Hong-die2,ZHANG Xiao-po1,2,CHEN Feng1,2. 1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy, Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify the flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)and their metabolites,as well as diarylheptanoids(yakuchinone A,yakuchinone B and oxyphyllacinol)and their metabolites,in rat urine and feces after oral administration of Suoquan capsules or pills.MethodsAfter male Sprague Dawleyoral rats were administratered Suoquan pills(3.54 g/kg)and Suoquan capsules (3.77 g/kg),they were placed into the metabolism of the cage.Their urine and dung were collected 12 h later.The dung was weighed and added 9 volumes of deionized water and then homogenized at high speed divided method.100 μl homogenate of urine and dung were taken into centrifuge tube,with 300 μl methanol added,shaked 5 min by vortex and centrifuged 10 min at 13 000 r/min.The supernatant were drawed and dried under N2.The residue was reconstituted using 50 μl methanol liquid,shaked and centrifugated again.40 μl supernatant was drawed and analyzed by liguid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).ResultsAccording to the peak LC-MS/MS case in the biological sample of the mentioned control group,comparing the urine and dungs sample before and after the administrated Suoquan pills and Suoquan capsules,we found that the main substances detected in urine and dungs were prototype form and were not detected the phaseⅡmetabolites,such as glucuronide metabolites,in rats after intragastric administration.ConclusionNootkatone,puzzle ketone A and Young shoots flavin and other ingredients are detected in the urine of rats,which may be the active constituents in regulating the bladder and bladder function.

Suoquan Pills;Suoquan Capsules;Urinary excretion;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）23—3433—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1345

2014-06-30)

海南省自然科學(xué)基金(編號：812189，813188)；海南醫(yī)學(xué)院青年培育基金(編號：HY2012-013)通訊作者：陳 峰。E-mail：cy.chen508@gmail.com