靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈氧化應(yīng)激的影響

馮艷，喬進(jìn)*，陳惠，鄭惠華

1南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通　226006；2江蘇安惠生物科技有限公司，南通　226001

靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈氧化應(yīng)激的影響

馮艷1，喬進(jìn)1*，陳惠2，鄭惠華2

1南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通226006；2江蘇安惠生物科技有限公司，南通226001

摘要目的：研究靈芝多糖對(duì)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈氧化應(yīng)激的影響。方法：SD大鼠經(jīng)過(guò)4周高脂飲食后腹腔注射鏈脲佐菌素（30 mg·kg-1）造模，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、靈芝多糖（GLPs）高、低劑量組。經(jīng)過(guò)12周給藥治療后，測(cè)定血清中過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平；然后胸主動(dòng)脈切片HE染色，觀察胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)及病理改變。結(jié)果：GLPs-H組血糖濃度較模型組相比均明顯下降（P＜0.01），血清CAT和GSH-PX水平較模型組相比均明顯上升（P＜0.01）；血清TC、TG含量較模型組相比均明顯下降（P＜0.01）。HE染色，與模型組相比，GLPs-H組光鏡下主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)皮損傷、中膜增厚的情況有所改善。結(jié)論：靈芝多糖可減輕糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，具有減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用，對(duì)糖尿病胸主動(dòng)脈并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有一定的預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞靈芝多糖；糖尿??；氧化應(yīng)激

糖尿病是多種病因引起的一種慢性高血糖為特征的代謝紊亂，是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足或靶組織對(duì)胰島素不敏感而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的疾病[1-2]。靈芝多糖（Ganoderma lucidumpolysaccharide，GLPs）是從靈芝中提取的有效活性成分，具有廣泛的藥理活性[3]。喬進(jìn)[4]等發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。

本研究給予2型糖尿病大鼠靈芝多糖，觀察靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及對(duì)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。

1　材料和方法

1.1藥品、儀器與動(dòng)物

靈芝多糖：江蘇安惠生物科技有限公司，純度74.03%（批號(hào)：100601）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：Sigma公司，臨用前用0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液；甘油三酯和總膽固醇試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司；BH-NIC-B型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

大鼠均購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔使用許可證號(hào)：FYXK（蘇）2007-0021〕，分籠喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組采用健康SD大鼠40只，雌雄各半，體重為160～180 g，分為正常對(duì)照組和造模組。正常組（N）10只：每天用生理鹽水灌胃一次，正常飲食；造模組30只高脂飲食（飼料配方：脂肪20%、奶粉5%、蛋黃粉5%、基礎(chǔ)飼料70%）喂養(yǎng)4周后造模（腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg·kg-1），成模大鼠取30只隨機(jī)均分為3組：①模型組（DM）：每天用生理鹽水灌胃一次。②靈芝多糖低劑量組（GLPs-L），200 mg·kg-1；③靈芝多糖高劑量組（GLPs-H），800 mg·kg-1；灌胃給藥12周。大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水，正常組普通飼料喂養(yǎng)，其余3組均高脂飲食。

1.2.2過(guò)氧化氫酶（CAT）活力測(cè)定測(cè)定原理為CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃的絡(luò)合物，在405 nm處測(cè)定其生成量，可計(jì)算出CAT的活力。具體操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，血清CAT活力以每毫升血清每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位。

1.2.3谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）含量的測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）可以促進(jìn)H2O2與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力可以用酶促反應(yīng)的速度來(lái)表示，測(cè)定此酶促反應(yīng)中GSH的消耗，則可求出酶的活力。具體操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，血清GSH-PX含量規(guī)定每0.1 mL血清在37℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4血清TC、TG含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)16周后，大鼠禁食12 h，20%烏拉坦腹腔注射麻醉，頸動(dòng)脈插管取血，2000 r·min-1分離血清，使用日立7170A全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）。

1.2.5HE染色甲醛固定胸主動(dòng)脈后，用石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，選取標(biāo)準(zhǔn)橫切面的切片進(jìn)行光鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1糖尿病大鼠空腹血糖測(cè)定

給藥12周末，禁食14～16 h后，經(jīng)尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。GLPs高低劑量組血糖濃度較DM模型組相比均明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1　大鼠空腹血糖水平

2.2血清過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平

STZ造模后，DM模型組血清CAT水平、GSHPX水平均明顯下降（與N組相比，P＜0.01）；與DM組相比，給藥后GLPs-H組CAT水平、GSH-PX水平明顯上升（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.3血清總膽固醇和甘油三酯水平

STZ造模后，DM組血清TC、TG水平均明顯升高（與N組相比，P＜0.01）；給藥后GLPs-H組較DM模型組相比均明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.4HE染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，光鏡下觀察各組大鼠主動(dòng)脈HE染色結(jié)果。N組：內(nèi)膜薄而均一，表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，中膜無(wú)增厚，平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則；DM組：內(nèi)膜增厚明顯，表面不光滑，內(nèi)皮細(xì)胞突起，形態(tài)不規(guī)則，中膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂；GLP-L組：形態(tài)比DM組略微好轉(zhuǎn)，中膜未見(jiàn)明顯增厚；GLPs-H組：內(nèi)膜局限性增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列較整齊，中膜增厚不明顯，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，程度較DM組明顯減輕（見(jiàn)圖1）。

表2　大鼠血清過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平（±s，n=10）

表2　大鼠血清過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平（±s，n=10）

與N組相比，a為P＜0.01；與DM組相比，b為P＜0.01

組別血清GSH-PX（酶活力單位）N組2618.43±336.05DM組1332.10±259.47aGLPs-L組1668.25±216.53GLPs-H組2236.20±270.51b劑量（mg·kg-1）血清CAT（U·mL-1）-13.57±3.204.02±0.95a2008.21±0.7580012.09±1.74b

表3　大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平（±s，n=10）

表3　大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平（±s，n=10）

與N組相比，a為P＜0.01；與DM組相比，b 為P＜0.01

組別TG（mmol·L-1）N組0.55±0.18DM組1.51±0.26aGLPs-L組1.37±0.14GLPs-H組1.06±0.15b劑量（mg·kg-1）TC（mmol·L-1）-1.33±0.256.23±0.51a2005.46±0.228004.54±0.38b

圖1　各組大鼠胸主動(dòng)脈HE染色（200×）

3　討論

長(zhǎng)期的高血糖引起全身多系統(tǒng)的代謝障礙，導(dǎo)致大血管和微血管的病變，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。本研究結(jié)果表明，通過(guò)靈芝多糖12周的干預(yù)，糖尿病大鼠的血糖明顯的降低，提示靈芝多糖可能對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的損傷有一定的修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素的分泌，從而使血糖降低。近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，氧自由基代謝參與了糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠體內(nèi)存在著明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象。氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在糖尿病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。干預(yù)氧化應(yīng)激既可以消除病因，如恢復(fù)血糖、血脂水平；也可從病理環(huán)節(jié)著手，如切斷氧化應(yīng)激發(fā)生、消除氧化應(yīng)激產(chǎn)物等。在體內(nèi)高糖環(huán)境下，機(jī)體一方面清除氧自由基酶（CAT，GSH-Px）的活性降低；另一方面體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成了大量氧自由基在體內(nèi)積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)一系列糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[6]。實(shí)驗(yàn)中，糖尿病成模大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激，血清過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平明顯降低，血清總膽固醇和甘油三酯水平明顯升高，而靈芝多糖對(duì)大鼠的脂代謝紊亂有明顯的改善作用。根據(jù)損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)，動(dòng)脈粥樣硬化首先由高血脂使動(dòng)脈的內(nèi)膜受到損傷引起，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，與血清TC、TG水平有關(guān)，同時(shí)氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展與血清中TC、TG水平有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)中，高劑量靈芝多糖能顯著降低大鼠血清中TC、TG水平，影像形態(tài)學(xué)顯示，靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈的內(nèi)膜有一定的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果提示，靈芝多糖對(duì)預(yù)防糖尿病體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有一定效果，說(shuō)明靈芝多糖可以作為糖尿病的輔助治療手段。

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中圖分類號(hào)R965.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1673-7806（2014）05-409-03

作者簡(jiǎn)介馮艷，女，主管藥師E-mail:894453062@qq.com

*通訊作者喬進(jìn)，男，碩士，主管藥師E-mail:felix_jo@163.com

收稿日期2014-05-07修回日期2014-07-04

Effect of Ganoderma Lucidum Polyccharide on Aorta Pectoralis Oxidative Stress

FENG Yan1,QIAO Jin1*,CHEN Hui2,ZHEN Hui-hua2
1Department of Pharmacy,the Third People's Hospital of Nantong 226001,China;2Jiangsu Anhui Biological Technology Co.Ltd,Nantong 226006,China

ABSTRACTObjective：To investigate the protective effects ofGanoderma lucidumpolysaccharide(GLPs) on the impairment of the aorta pectoralis in the STZ induced diabetes mellitus(DM)rats and to explore the effects of GLPs on the oxidative stress in DMrats.Methods：SD rats were fed with high fat diet for 4 weeks,then injected STZ(30 mg·kg-1)to replicate type 2 diabetic rats.The successful diabetic model rats were randomized into normal control group,diabetes group,Ganoderma lucidumpolysaccharides of low and high-dose groups.After 12 week's treatment,the activity of catalase(CAT)and glutathione peroxidase (GSH-PX),the levels of total cholesterol(TC)and triglycerides(TG)in serumwere detected.Slice of aorta pectoralis were stained with HE to observe ultramicro structure and patho-change of aorta pectoralis.Results：The blood glucose concentration of the GLPs-H group was lower than that of the diabetes group(P＜0.01);the activities of catalase and glutathione peroxidase in serumwere significantly higher in the GLPs-H group than in the diabetes group(P＜0.01);The levels of TC and TG in serumwere significantly lower in the GLPs-H group than in the diabetes group(P＜0.01).When observed under light microscope for HE stains,compared with the DMgroup with aortic tunica intima incrassation,injury of endodermis and tunica media incrassation,the GLPs-H group showed less damages.Conclusion：There is a confirmed action of GLPs in depressing oxidative stress and lipid peroxidation of the diabetes rats,and GLPs play a role in the prevention of diabetic complications of aorta pectoralis.

KEY WORDSGanoderma lucidumpolysaccharides;Diabetes mellitus;Oxidative stress