Biruloquinone的體外BACE酶抑制活性

摘要：本文以瘦柄紅石蕊Cladonia macilenta次生代謝產(chǎn)物biruloquinone為對(duì)象，研究其體外BACE酶抑制活性。結(jié)果顯示，biruloquinone對(duì)BACE的抑制與濃度正相關(guān)，濃度為100微克/毫升時(shí)，抑制率達(dá)68.36%，對(duì)酶活抑制50%的濃度（IC50）為62.3微克/毫升（191微米）。

關(guān)鍵詞：瘦柄紅石蕊；Biruloquinone；BACE抑制活性

中圖分類(lèi)號(hào)：R96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1674-0432（2014）-06-28-1

瘦柄紅石蕊（Cladonia macilenta Hoffm.）是地衣門(mén)（Lichenes）、子囊衣綱（Ascolichens）、石蕊科（Cladoniaceae）、石蕊屬（Cladonia）的一種朽木生地衣。據(jù)報(bào)道，羅姮[1]等首次從C. Macilenta中分離出一種自然界罕見(jiàn)的菲醌化合物biruloquinone。該類(lèi)化合物已被發(fā)現(xiàn)具有多種重要的活性，如丙肝肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制劑活性、CD45抑制劑活性等[2]，但對(duì)其BACE抑制劑活性研究未見(jiàn)報(bào)道。在阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病機(jī)制中，β分泌酶（BACE1）是產(chǎn)生淀粉樣β蛋白（Aβ）的關(guān)鍵分子[3]，BACE1抑制劑的研發(fā)在AD治療方面已成為社會(huì)及醫(yī)藥工業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一[4]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株：瘦柄紅石蕊采集于云南省，地衣標(biāo)本存放于昆明植物研究所標(biāo)本館（CH050136），地衣體經(jīng)內(nèi)生真菌分離得到的紫色C.macilenta LFF保存于韓國(guó)地衣資源銀行（KOLABIC），國(guó)立順天大學(xué)。

試劑藥品：β-分泌酶（BACE）抑制劑篩選分析試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠），Synergy HT多功能微孔板酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Biruloquinone的提取和分離 將地衣型真菌瘦柄紅石蕊的菌絲體接種于PDB培養(yǎng)基中（5瓶×300毫升/1000毫升三角瓶），15℃、150轉(zhuǎn)/分避光培養(yǎng)30天（發(fā)酵液呈深紫色），將全部1.5L發(fā)酵液，用乙酸乙酯等體積萃取24小時(shí)。將有機(jī)層通過(guò)Whatman No.1定性濾紙除去菌絲體。重復(fù)兩次該過(guò)程，并將提取液合并，40℃真空濃縮至500毫升。將濃縮的提取物過(guò)硅膠柱（230～400目，3.5×80厘米）純化，用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（90∶20∶2，v/v，4升）洗脫，得到暗紫色組分（980毫升），將該組分集中在真空30℃濃縮，獲得110mg biruloquinone固體粗提物。然后將粗提物用氯仿-甲醇重結(jié)晶法純化（1：1，v/v），得到35mg暗紫色的biruloquinone晶體。

1.2.2 Biruloquinone的體外BACE抑制實(shí)驗(yàn) 樣品準(zhǔn)備：將biruloquinone配成6.25，12.5，25，50，75，100微克/毫升的質(zhì)量濃度。BACE酶抑制率的測(cè)定：（1）向背景值檢測(cè)孔加95微升檢測(cè)緩沖液和2.5微升 80%乙醇溶液；（2）向空白對(duì)照孔加92.5微升檢測(cè)緩沖液，2.5微升 80%乙醇和2.5微升 BACE；（3）向樣品檢測(cè)孔分別加95微升檢測(cè)緩沖液，2.5微升不同濃度的biruloquinone和2.5微升 BACE；（4）向所有檢測(cè)孔加2.5微升酶作用底物（10微米），輕輕震蕩混勻，室溫孵育40 分；（5）使用酶標(biāo)儀以激發(fā)光（excitation，ex）340nm-發(fā)射光（emission，em）500nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度；（6）每個(gè)檢測(cè)孔3個(gè)重復(fù)，根據(jù)以下公式計(jì)算平均抑制率：

抑制率I（%）=[（A2-A3）/A3-A1]×100%

其中：A1為緩沖液背景值；A2為抑制前酶活性；A3為抑制后剩余酶活性。

2 結(jié)果與討論

Biruloquinone體外BACE抑制活性：本實(shí)驗(yàn)采用重組人BACE-1，熒光底物含有一個(gè)強(qiáng)熒光7-甲氧基香豆素基團(tuán)，BACE能切割熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間的肽酶活性，使熒光增強(qiáng)。因此可以根據(jù)熒光的變化值來(lái)判斷樣品對(duì)BACE的抑制活性。從圖1可知，biruloquinone對(duì)BACE的抑制與濃度正相關(guān)，抑制率隨濃度增加而迅速提高，對(duì)酶活抑制50%的濃度（IC50）為62.3微克/毫升（191微米）。在最大濃度為100微克/毫升時(shí)，抑制率達(dá)68.36%，由此可知，biruloquinone具有較強(qiáng)的BACE抑制活性。

圖1 Biruloquinone對(duì)BACE抑制作用曲線

3 結(jié)語(yǔ)

Biruloquinone具有較強(qiáng)的BACE抑制劑活性，在最大濃度為100微克/毫升時(shí)，清除率可達(dá)68.36%（IC50=62.3微克/毫升）。由此可見(jiàn)，biruloquinone具有一定的治療AD的能力，這種特性為將瘦柄紅石蕊的次生代謝產(chǎn)物biruloquinone開(kāi)發(fā)成為多靶點(diǎn)的抗AD的天然藥物提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Biruloquinone ， an Acetylcholinesterase Inhibitor Produced by Lichen-Forming Fungus Cladonia macilenta[J].Microbiol. Biotechnol，2013， 23（2）：161-166.

[2] 魏其艷，羅應(yīng)岡，張國(guó)林.菲醌的生物活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2005，17（5）：665-668.

[3] Cai H， Wang Y， McCarthy D， et al. BACE1 is the major β-secretase for generation of Aβ peptides by neurons[J]. Nat Neurosci， 2001， 4（3）： 233-234.

[4] 周金武，程肖蕊，程軍平，等.BACE1抑制劑分子水平高通量篩選體系的建立[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2010，37（4）：302-309.

作者簡(jiǎn)介：代歡歡，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士研究生，研究方向：菌物生態(tài)學(xué)。