瑞舒伐他汀對ApoE基因缺陷小鼠主動脈α—SMA表達的影響

摘要：目的 探討瑞舒伐他汀對ApoE基因缺陷小鼠主動脈粥樣硬化及α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin， α-SMA）表達的影響。研究瑞舒伐他汀抗動脈粥樣硬化（AS）降脂外的可能機制。方法 將20只6 w齡雄性ApoE基因缺陷小鼠隨機分為兩組：陽性對照組10只，予高脂飼料和飲水；瑞舒伐他汀組10只，予高脂飼料、飲水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d； 另設同周齡野生雄性小鼠10只作為陰性對照組：予普通飼料、飲水喂養。三組小鼠喂養13 w后，摘出眼球并測定血清中總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）的水平等生化指標。然后處死小鼠并取出主動脈（從主動脈弓起始到腹主動脈分支處），常規HE染色及免疫組織化學染色，觀察主動脈形態學變化和血管壁斑塊組織變化，定量分析斑塊面積與管腔面積之比（PA/LA）、血管內膜厚度（IMT），定性分析α-SMA表達強度的變化。結果 6 w齡ApoE基因缺陷雄性小鼠喂養13 w后，與陽性對照組比較，瑞舒伐他汀組血清TCH、TG、LDL-C水平顯著降低，兩組差別有統計學意義；病理測定PA/LA及IMT，瑞舒伐他汀組較陽性對照組明顯減小，差別有統計學意義；與陽性對照組比較，瑞舒伐他汀組血管壁組織α-SMA表達減少有統計學意義。結論 瑞舒伐他汀可減少動脈粥樣硬化病變中α-SMA表達，其抗動脈粥樣硬化降脂外作用可能為阻止血管平滑肌細胞向動脈粥樣硬化斑塊中遷移有關。

關鍵詞：瑞舒伐他汀，ApoE基因缺陷小鼠，AS，α-平滑肌肌動蛋白

動脈粥樣硬化（AS）是眾多心腦血管疾病共同的病理生理基礎，也是心血管系統疾病中最常見的疾病，嚴重危害人類疾病。目前他汀類藥物已被公認為具有抗AS作用，越來越多的研究表明它在抗AS的形成和發展方面，除了降脂作用外還有很多調脂外的抗AS機制，如抑制血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移和增殖。血管a-SMA屬于細胞骨架微絲的基本成分之一，特異性的在VSMC中表達， 其相對含量是判斷VSMC表型的重要指標。收縮表型細胞中主要以α-SAM為主，VSMC中α-SAM的減少提示細胞由收縮表型向增殖表型轉化。本實驗通過觀察瑞舒伐他汀對AS板塊中α-SAM表達的影響，進一步探討其抗AS的降脂外作用。

1資料與方法

1.1藥物和動物試驗資料

1.1.1動物 健康野生型雄性小鼠10只，APOE基因缺陷雄性小鼠20只，體重18.5～21.1 g，購自南京醫科大學實驗動物中心。

1.1.2藥物 瑞舒伐他汀，商品名可定，由阿斯利康制藥有限公司提供。

1.1.3飼料 基礎飼料及高脂飼料均由南京醫科大學實驗動物飼料廠提供。高脂飼料配方：10%豬油，2%膽固醇，0.2%膽酸鈉，87.8%普通飼料。

1.1.4主要試劑及儀器 TC、TG、LDL-C試劑盒，由江蘇建成公司生產。光鏡病理試劑均由武漢博士德生物工程有限公司生產。ABC免疫組化染色試劑盒、日立7600-010全自動生化分析儀、日本歐林巴斯彩色病理圖像分析系統。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 陰性對照組：6 w齡雄性野生型小鼠10只，給普通飼料、飲水喂養。將20只6 w齡APOE基因缺失雄性小鼠隨機分為兩組：陽性對照組10只，予高脂飲食、飲水；瑞舒伐他汀組10只，給予高脂飲食、飲水和瑞舒伐他汀10 mg/Kg/d。三組喂養時間均為13 w。

1.2.2樣本采集 樣本采集前12 h禁飲禁食，小鼠麻醉后，經眼眶取血，分離血清，測定血脂等生化指標。處死小鼠，取出主動脈（自主動脈弓至腹主動脈分叉處），生理鹽水沖洗，4%甲醛中固定。常規石蠟包埋，從主動脈弓部起間斷均勻切片，切片厚度為5 um，每只取5張切片。

1.2.3生化指標檢測 血樣送南京市第一醫院生化室全自動數字生化分析儀測定血脂等。

1.2.4病理學測定 病理學測定在南京市第一醫院病理科完成，每組隨機取5個標本進行蘇木素-伊紅染色（HE染色），普通光鏡觀察形態學改變；每個標本取2張切片（每隔2張取1張）用纖維彩色圖像處理，共計10個視野進行測量統計，測量指標包括：斑塊面積與管腔面積之比（PA/LA）；血管內膜厚度（IMT）。每組選用五個斑塊較明顯的做統計分析。

1.2.5免疫組化 免疫組化在南京市第一醫院病理科完成。檢測通過ABC法染色，觀察各組主動脈血管壁斑塊組織α-SMA表達水平。

1.2.6統計學處理 本實驗所檢驗變量均為連續性變量，且經SPSS的P-P圖檢驗后均符合正態分布，故各數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較首先行方差齊性檢驗，方差不齊使用非參數檢驗（Kruskal Wallistest），方差齊采用方差分析。方差分析檢驗結果示各組間差異存在統計學意義后運用SNK法檢驗進行所有組間的兩兩比較。以α=0.05為檢驗水準，采用SPSS 17.0統計軟件包對實驗數據進行統計學處理。

2結果

2.1各組血脂結果 與陰性對照組相比，陽性對照組、瑞舒伐他汀TCH、TG及LDL-C均明顯升高（P<0.05），提示ApoE基因缺陷小鼠存在明顯血脂紊亂；與陽性對照組相比，瑞舒伐他汀組TCH、TG、LDL-C降低，統計學差別有意義（P<0.05），見表1。

2.2病理形態學改變及病理測定 陰性對照組小鼠動脈血管各層結構完整，內膜薄，由單層內皮細胞構成。陽性對照組內膜明顯增厚，內含較多的泡沫細胞，VSMC向內膜突起。瑞舒伐他汀干預組較陽性對照組病變有明顯較輕。見圖1。

2.3小鼠主動脈α-SMA的表達 陰性對照組小鼠血管壁細胞漿內有黃褐色顆粒狀物表達；陽性對照組血管壁及AS斑塊表面胞質中有大量棕黃色顆粒，比陰性對照組表達更明顯；瑞舒伐他汀組血管壁及AS斑塊表面胞質中棕黃色顆粒較陽性對照組少，但比陰性對照組多，見圖2。

3討論

瑞舒伐他汀是一種新型、安全、高效、化學合成的最具成本效益比的劑效依賴性的他汀類降脂藥物， 是目前降低LDLC作用最強的調脂藥物。本實驗結果顯示與陽性對照組比較，瑞舒伐他汀組血脂水平顯著減低（P<0.05），進一步證明瑞舒伐他汀具有較強的降脂作用，與STELLAR研究[3]結果一致。

與陽性對照組比較，瑞舒伐他汀組小鼠的AS形態學改變、PA/LA及IMT均較陽性對照組明顯減輕，進一步證明瑞舒伐他汀鈣可產生抗AS作用， 減少動脈粥樣斑塊形成。陽性對照組動脈α-SMA表達明顯高于陰性對照組， 差異有統計學意義， 提示α-SMA表達在AS的發病過程中起著重要的作用。瑞舒伐他汀鈣干預組與陽性對照組相比α-SMA表達明顯減少， 差異有統計學意義，提示瑞舒伐他汀抗AS的機制與減少動脈α-SMA表達有關。Mathapati S[1]實驗表明高膽固醇飲食喂養的兔AS模型中主動脈粥樣斑塊中α-SMA的表達增加。Igarashi M[2]實驗表明，在頸動脈內皮球囊剝脫的兔的AS模型中，HMG-CoA還原酶抑制劑 BAYw6228可以減少頸動脈新生內膜組織中α-SMA的表達、VSMC的增殖以及新生內膜的增厚。這些結果和本實驗都是一致的。隨著AS的發生，動脈壁的VSMC發生增殖和遷移，增殖型VSMC有很少的α-SMA表達，有理由推測，在本實驗中AS斑塊中發生了大量VSMC的遷移，正是這些遷移至AS斑塊中的收縮型VSMC表達了α-SMA，而瑞舒伐他汀可以阻止VSMC向AS斑塊中遷移，從而發揮抗AS的作用。至于瑞舒伐他汀是通過什么途徑阻止VSMC向AS斑塊中遷移的，暫且不甚明確，下面將設計新的實驗進一步進行研究。

本實驗進一步證明：他汀類降脂藥抗AS機制中除了降脂作用外，還存在降脂外作用，抑制VSMC增殖及遷移是降脂外作用之一。瑞舒伐他汀具有降低血脂及減輕AS病變的作用，但與正常對照組相比，血脂水平仍偏高，仍存在AS病變，這說明在降低血脂及減輕AS病變的治療中，我們不僅需要考慮藥物的治療作用，還需注意飲食、家族遺傳的因素的影響。

參考文獻：

[1]Mathapati S， Arumugam SB， Verma RS. High cholesterol diet increases MMP9 and CD40 immunopositivity in early atherosclerotic plaque in rabbits[J].Acta Histochem， 2010， 112（6）： 618-623.

[2]Igarashi M， Takeda Y， Mori S， et al. Suppression of neointimal thickening by a newly developed HMG-CoA reductase inhibitor， BAYw6228， and its inhibitory effect on vascular smooth muscle cell growth[J].British Journal of Pharmacology， 1997， 120： 1172 -1178.

編輯/張燕