耐多藥結(jié)核病研究進展

結(jié)核病是當(dāng)前危及人類生命的主要殺手。耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核?。╩ultiple drug resistant tuberculosis， MDR-TB）的出現(xiàn)使得結(jié)核病流行態(tài)勢更為嚴峻。耐多藥結(jié)核病是指結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）至少同時對異煙肼、利福平這2種一線抗結(jié)核藥物耐藥[1]，由于其傳統(tǒng)診斷方法周期長，且治療過程復(fù)雜、療程長、費用高、治愈率低、容易導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，耐多藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生和播散，已成為新世紀結(jié)核病控制的三大難題之一[2]。據(jù)WHO估計，2012年全球結(jié)核病新患者中耐多藥率約為3.6%，復(fù)治患者耐多藥率約為20.2%，全球約有45萬人患耐多藥結(jié)核病，17萬人死于耐多藥結(jié)核病[3]， 全球1/4的MDR-TB患者在中國，中國耐多藥結(jié)核病負擔(dān)位居全球第二[4]。2008年我國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告顯示：我國結(jié)核病耐多藥情況嚴重，從涂陽肺結(jié)核患者分離的結(jié)核分支桿菌耐多藥率為8.32%，其中新患者的發(fā)病率為5.71%，復(fù)治患者的發(fā)病率為25.64%，我國每年新發(fā)MDR-TB患者約12萬例[5]。可見，全球結(jié)核病耐多藥問題嚴重，需引起高度重視。

1 MDR-TB產(chǎn)生的原因及機制

臨床上將MDR-TB分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性MDR-TB指從未接受過抗結(jié)核化療或治療時間小于1個月的患者感染了耐多藥菌株所致的結(jié)核病，是耐多藥菌株傳播所致；繼發(fā)性MDR-TB指感染敏感菌株的患者，由于治療不當(dāng)（治療時間>1個月）等原因引起的耐多藥結(jié)核病。

耐藥結(jié)核病由來已久，自1944年將鏈霉素引入結(jié)核病治療后不久，即出現(xiàn)了耐鏈霉素的MTB菌株。目前，MTB對單個抗結(jié)核藥物耐藥的分子機制已比較明了，編碼抗結(jié)核分枝桿菌藥物作用靶點及相關(guān)代謝酶的染色體基因在復(fù)制過程中發(fā)生自發(fā)突變是結(jié)核桿菌耐單藥產(chǎn)生的主要分子機制[6]：例如MTB對異煙肼耐藥主要由基因katG、inhA、ahpC發(fā)生突變引起[7-9]，對利福平耐藥由基因rpoB發(fā)生突變引起[10]，而對氟喹諾酮類抗結(jié)核藥耐藥則是由于基因gyrA或gyrB發(fā)生了突變[11]。但這種自發(fā)突變發(fā)生頻率僅為10-5～10-8，不像大多數(shù)細菌那樣通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)位子等可移動遺傳元件的水平遷移介導(dǎo)。且由于各個耐藥基因位點是相互獨立的，MTB不會因某個耐藥基因發(fā)生突變而導(dǎo)致同時對2種以上藥物的耐藥，故MTB自發(fā)同時對2種藥物耐藥的幾率幾乎為零。由此可見，自然條件下MTB出現(xiàn)耐多藥的情況幾乎不可能。但臨床上卻頻頻檢測出耐多藥MTB菌株，這主要由人為因素造成：人為失誤如藥物不規(guī)則供應(yīng)、醫(yī)生的不規(guī)則處方、患者差的依從性等導(dǎo)致耐藥基因突變的擴增而產(chǎn)生臨床上的單耐藥（與自發(fā)突變相比頻率大大增加），參與單耐藥的不同基因突變連續(xù)累計最終導(dǎo)致耐多藥即繼發(fā)性MTB[12]。

2 MDR-TB的診斷方法

耐多藥結(jié)核病的診斷主要為結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗（Drug susceptibility testing， DST），其中DST是傳統(tǒng)、經(jīng)典的MDR-TB診斷方法，其結(jié)果為確診MDR-TB的唯一標(biāo)準，該方法廉價、準確、可靠，但耗時較長，一般需要6～12 w13]，不僅延誤患者治療，還可能造成耐多藥結(jié)核分枝桿菌在人群中傳播，不利于疾病的控制。近年來，隨著國際上對MDR-TB的重視，快速診斷技術(shù)的研究也取得了重大進展。

2.1表型診斷技術(shù)

2.1.1液體培養(yǎng)技術(shù) 傳統(tǒng)的DST是在固體培養(yǎng)基上直接或者間接進行的，直接試驗將濃縮的痰標(biāo)本直接接種到含藥或不含藥的培養(yǎng)基里，間接試驗則是將痰培養(yǎng)出的MTB菌落接種后再進行相應(yīng)的DST（包括絕對濃度法、比例法和抗性比率法）。間接試驗最常用，是耐藥結(jié)核病診斷的金標(biāo)準[14]。但無論是直接試驗或者是間接試驗，均須花費較長時間。

自動液體培養(yǎng)系統(tǒng)（automated liquid mediasystems ， ALMS）（如BACTEC MGIT 960）用液體培養(yǎng)基代替了傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基，可大大縮短涂陽患者標(biāo)本的DST時間（平均14 d）[15]。雖然與固體培養(yǎng)相比該系統(tǒng)設(shè)備價格昂貴，且需要不斷購買實驗耗材，但在資源有限、試驗負荷高的情況下，當(dāng)需要快速檢測而其他方法又缺乏敏感性時（如HIV陽性或懷疑有耐多藥、廣泛耐藥感染，需要在最短的時間內(nèi)制定個體化治療方案），ALMS卻是最經(jīng)濟實惠的。正因為如此，WHO甚至在2007年推薦中低收入國家使用ALMS[16]。

2.1.2其他快速表觀診斷技術(shù) 傳統(tǒng)的藥敏試驗須在生物安全三級實驗室內(nèi)進行，且對實驗人員相關(guān)知識技能要求較高，須進行長時間、詳細地培訓(xùn)，難以在全球廣泛應(yīng)用，故迫切需要研究出快速且對實驗條件要求低、操作簡單的診斷技術(shù)。近年，這方面的研究已取得一定進展，例如硝酸還原酶法、薄層瓊脂顯色試驗、氧化還原指示劑比色法等，這些方法都使用廉價而通用的實驗室材料，不需要對試驗人員進行太多培訓(xùn)，但也都有各自的局限性。

2.2基因?qū)W診斷技術(shù)

2.2.1線性探針檢測（Line-probe Assays） 線性探針檢測通過把MDR-MTB耐藥基因片段擴增產(chǎn)物與固定在膜上的寡核苷酸探針雜交進行檢測，目前主要有3種MDR-TB的線性探針檢測儀器：INNO-LiPA Rif.TB（只能檢測耐利福平MTB）、GenoType MTBDR/MTBDRplus（能同時檢測耐利福平和異煙肼MTB） 和 Geno-Type MTBDRsl（可檢測耐氟喹諾酮類、注射用二線抗結(jié)核藥、乙胺丁醇MTB）。研究顯示，INNO-LiPA Rif.TB 檢測分離出的菌株靈敏度大于95%，特異度為100%，而直接檢測臨床樣本時靈敏度80%～100%，跨度較 大[17]；GenoType MTBDR/MTBDRplus在檢測耐利福平MTB時具有高的敏感度和特異度，但檢測耐異煙肼MTB時結(jié)果相差很大[18]；而GenoType MTBDRsl對耐二線抗結(jié)核藥MTB的檢測結(jié)果的靈敏度、特異度相差也較大[19]。

2.2.2 Xpert MTB/RIF 由美國Cepheid公司開發(fā)的Xpert MTB/RIF是一個全自動一體化的快速PCR儀，集痰標(biāo)本處理、DNA提取與擴增、耐利福平基因rpoB突變檢測于一體，整個過程在全封閉的內(nèi)部自動進行，無生物安全要求，全過程僅需約2 h，能大大減弱其他基因?qū)W檢測方法的許多局限性。研究顯示，用Xpert MTB/RIF檢測培陽分離株，靈敏度可達98.2%；而檢測涂陰培陽分離株靈敏度卻只有72.5%，當(dāng)增加兩次檢測后，總的靈敏度可增高到90.2%；Xpert MTB/RIF檢測特異度可達99.2%[20]。2010年，Xpert MTB/RIF獲WHO批準應(yīng)用于結(jié)核病診斷，并被譽為革命性突破，為2011年WHO重點推薦技術(shù)。

3 MDR-TB的治療

3.1藥物治療 耐多藥結(jié)核患者治療的國際準則是圍繞世界衛(wèi)生組織的DOTS-Plus框架制定的：①以藥物敏感試驗結(jié)果為依據(jù)，選擇新藥、敏感藥，以增加一線抗結(jié)核藥物和二線抗結(jié)核藥物的數(shù)量組成化療方案為準則；②必須使用四到六種有效的或相近有效的藥物，包含一種氟哇諾酮類藥物和注射藥物；③注射藥物至少使用6個月，治療痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后必須持續(xù)18個月；④藥物應(yīng)該1次/d或6次/w服用，強化期至少3個月，總療程21個月以上[21]。主要有以下3種治療策略：①標(biāo)準化治療：在缺乏個體化藥敏試驗的情況下，根據(jù)有代表性的患者群體耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)設(shè)計治療方案。同一組或同一類別的所有患者使用同一治療方案。MDR-TB可疑者應(yīng)盡可能通過藥敏試驗確診；②經(jīng)驗性治療：根據(jù)患者既往抗結(jié)核治療史以及有代表性的患者群體耐藥監(jiān)測資料分別設(shè)計每一方案。經(jīng)驗性治療通常會根據(jù)隨后獲得的藥敏試驗結(jié)果進行調(diào)整；③個體化治療：根據(jù)患者的抗結(jié)核治療史和個體藥敏試驗結(jié)果確定每個方案。

現(xiàn)有藥物對MDR-TB的治療療程長、不良反應(yīng)強烈，且治療成功率低（2010年隊列治療成功率最高為東地中海地區(qū)的56%）[22]，故對抗結(jié)核病新藥的研究顯得尤為重要。近年，一些藥物研究已取得可喜進展，例如TMC-207、PA-824、利萘唑酮（linezolid）、SQ-109等都已處在臨床試驗階段[23]。

3.2手術(shù)治療 對于伴有嚴重的空洞型肺結(jié)核、肺葉或一側(cè)全肺毀損、支氣管胸膜瘺或狹窄、支氣管內(nèi)膜結(jié)核、大咯血以及化療失敗的MDR-TB 患者，可考慮手術(shù)治療， 以提高治愈性， 降低復(fù)發(fā)的可能性，但雙側(cè)廣泛性肺病變的患者不宜手術(shù)治療[24]。Xu等人通過Meta分析，得出外科干預(yù)與MDR-TB患者的預(yù)后成正相關(guān)的結(jié)論[25]。

3.3免疫治療 肺結(jié)核病患者免疫水平往往也處于較低水平[26]，耐多藥患者表現(xiàn)得尤為突出，即使給予這些患者已被證明有效的抗結(jié)核化療可能也難以控制結(jié)核病的進展，為此在化療中輔以免疫治療，有可能提高患者的細胞免疫水平，提高治愈率。已經(jīng)用于臨床的免疫治療有母牛分枝桿菌（Mycobacterium vaccae）、重組IFN-γ、IL-2等[27]。如Yang等對母牛分枝桿菌輔助治療初治結(jié)核病做了Meta分析，結(jié)果表明母牛分支桿菌可提高MTB患者痰涂陰轉(zhuǎn)率、加快病灶的吸收，并有利于結(jié)核空洞的閉合[28]。

3.4其他治療方法 其他方法如介入治療[27]、中藥治療[29]、皮質(zhì)類固醇治療[14]等均可作為化療的輔助治療，可根據(jù)不同情況加以選擇。

4 MDR-TB的防制策略

針對MDR-TB越發(fā)嚴重的疫情，1998年WHO在DOTS的基礎(chǔ)上提出來DOTS-Plus策略，它包括5個基本要素：①持續(xù)不變的政府承諾；②合理的患者發(fā)現(xiàn)策略，通過質(zhì)量保證下的培養(yǎng)和藥敏試驗（DST）診斷MDR-TB；③二線抗結(jié)核藥物使用的合理治療策略；④確保有高質(zhì)量保證的抗結(jié)核藥物的不間斷供應(yīng)；⑤制定適合DOTS-Plus規(guī)劃的標(biāo)準登記報告系統(tǒng)。我國在世界衛(wèi)生組織提出的DOTS和DOTS-Plus策略的基礎(chǔ)上， 還制定了諸如將各種醫(yī)療機構(gòu)納入國家結(jié)核病控制規(guī)劃、限制抗結(jié)核藥物、人力資源發(fā)展戰(zhàn)略和使用固定劑量復(fù)合制劑等具體戰(zhàn)略，通過實施這些策略取得了一些成績[30]。

5展望

綜上所述，耐多藥結(jié)核病危害嚴重，對個人、家庭、社會均造成極大負擔(dān)，雖然全球耐多藥結(jié)核病防治工作在各方面已取得不錯成績，但疫情依舊嚴峻，我們在加強醫(yī)防合作的同時，需要繼續(xù)加大人力、物力投入，加強對耐多藥分子機制、快速準確廉價診斷技術(shù)、新藥開發(fā)及治療方法等的研究，并及時進行新方法、新策略的效果評價，爭取早日將MDR-TB的危害降到最低。

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編輯/肖慧