E3泛素連接酶HECTD3真核表達質粒的鑒定

摘要：目的 鑒定E3泛素連接酶 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，HECTD3） 基因的真核表達質粒。方法 提取無內毒素真核表達質粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉染進卵巢癌細胞SKOV-3細胞，qRT-PCR法和蛋白質免疫印跡技術檢測該基因的表達情況。結果 真核表達質粒pcDNA-HECTD3可以顯著地提高HECTD3基因在mRNA和蛋白水平的表達量。結論 HECTD3基因的真核表達質粒構建成功，可以用于后續(xù)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學研究。

關鍵詞：E3泛素連接酶；卵巢癌；真核表達質粒

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，僅2011年1年就導致全世界140000人死亡[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一個功能目前尚未闡述清楚的新的E3泛素連接酶[2]。有報道指出該基因可能在乳腺癌和宮頸癌中介導順鉑的化療耐受[3]，但尚未有人報道HECTD3在卵巢癌中的作用。實驗室前期構建該基因真核表達質粒pcDNA-HECTD3，本研究將鑒定該真核表達質粒在胞內對HECTD3基因表達情況的影響，為進一步研究HECTD3基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供有力的工具和手段。

1實驗材料

卵巢癌細胞SKOV-3和真核表達質粒pcDNA-HECTD3由本室保存。Trizol、Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司。逆轉錄試劑盒cDNA Synthesis Kit （M-MLV Version）、SYBR○RPremix Ex Taq II（Ti RNaseH Plus）購自TaKaRa公司。Endo-free Plasmid Extraction Kit II購自omega公司，細胞裂解液購自碧云天，蛋白酶抑制劑cocktail購自Roche公司。Anti-HECTD3鼠多抗、anti-β-actin鼠單抗、辣根過氧化酶偶聯(lián)的鼠二抗購自abcam公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自millipore公司。引物由invitrogen公司合成。

2實驗方法

2.1 qRT-PCR 提取無內毒素質粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉染進卵巢癌細胞SKOV-3，24 h后提取細胞總RNA，并將其逆轉錄為cDNA，此為qRT-PCR模板。內參Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）上游引物序列：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'，下游引物：5'- TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'；HECTD3的上游引物：5'- CAGGCAGGTCTGCTGAAGGT-3'，下游引物：5'-CGAGTCAGATGGCTCGAAGT

C-3'。qRT-PCR反應體系如下：SYBR 10 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，DNA模板 100 ng，用雙蒸水補至20 μL體積。qRT-PCR反應條件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s（40個循環(huán)）40℃ 1 min。實驗重復3次，用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。

2.2蛋白質免疫印跡 提取無內毒素質粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉染進卵巢癌細胞SKOV-3，48 h后提取細胞總蛋白，經SDS-PAGE后電轉移至PVDF膜上，置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉2 h，室溫孵育一抗2 h （HECTD3，1∶500；β-actin，1∶5000），TBST洗3次×15 min，分別加入辣根過氧化酶偶聯(lián)的鼠二抗（1∶10000），室溫孵育1 h，TBST洗3次×15 min，化學發(fā)光試劑盒ECL顯色。

3實驗結果

利用qRT-PCR技術檢測HECTD3在卵巢癌細胞中的mRNA水平的表達情況，見圖A。由圖可以看出，轉染了表達質粒pcDNA-HECTD3的細胞中HECTD3在mRNA水平的表達量是對照組的3.489倍，且P<0.01。同時采用免疫印跡技術檢測HECTD3蛋白在兩種細胞中的表達量變化，見圖B。可以看出，轉染了pcDNA-HECTD3質粒的細胞中HECTD3蛋白表達豐度較對照組明顯提高。由此說明，我們成功構建了HECTD3基因的真核表達質粒，且將該質粒轉染進卵巢癌SKOV-3細胞之后能夠在mRNA水平和蛋白水平顯著地提高該基因的表達豐度。

HECTD3在mRNA水平和蛋白水平的表達情況（A）將質粒轉染至SKOV-3中，24 h后檢測HECTD3基因在mRNA水平的表達情況，**表示P<0.01。（B）將質粒分別轉染至SKOV-3中，48 h后檢測HECTD3蛋白水平的表達情況。

4討論

利用酵母雙雜交技術Yu J等人發(fā)現了一個新的E3泛素連接酶HECTD3基因[4]。有學者通過免疫共沉淀技術發(fā)現HECTD3可能參與了神經元的發(fā) 育[5]。Li Y等報道在乳腺癌和宮頸癌細胞中抑制E3泛素連接酶HECTD3表達后能促使癌細胞對順鉑增敏[3]。目前尚未有在卵巢癌中研究HECTD3基因功能的報道，因此本研究首先在體外卵巢癌細胞中驗證了該基因真核表達的情況。在后續(xù)的研究中，我們將構建穩(wěn)定表達HECTD3基因的SKOV-3細胞系，同時深入探討體外過表達該基因所引起的一些列細胞學變化及其具體的分子機制。

參考文獻：

[1]Jemal A，Bray F，Center M M， et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2]Mattern M R， Wu J， Nicholson B.Ubiquitin-based anticancer therapy： carpet bombing with proteasome inhibitors vs surgical strikes with E1， E2， E3， or DUB inhibitors[J].Biochim Biophys Acta，2012，1823（11）：2014-2021.

[3]Li Y， Chen X， Wang Z，et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1[J].Neoplasia，2013，15（1）：39-48.

[4]Yu J， Lan J， Zhu Y， et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，367（4）：805-812.

[5]Zhang L， Kang L， Bond W， et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3， a HECT domain ligase[J]. Cell Mol Neurobiol，2009，29（1）：115-121.

編輯/肖慧