做好免疫組織化學染色的幾個注意點

摘要：免疫組織化學染色方法是根據抗原抗體特異性結合，通過熒光或化學顯色檢測細胞或組織中抗原的含量和分布，具有特異性強、靈敏度高和定位準確等特點。本文主要從抗體孵育條件、設置合理對照、固定液的洗脫、抗原修復和洗片等步驟討論如何做好免疫組織化學染色。

關鍵詞：免疫組織化學染色；抗體；組織固定；抗原修復

免疫組織化學染色方法是目前生命領域研究最常用的實驗方法之一，也是臨床病理診斷從細胞形態水平提高到分子水平的關鍵技術環節。免疫組織化學染色方法主要應用免疫學中抗原抗體結合的實驗原理檢測特定抗原在細胞或組織中的表達和分布。影響免疫組織化學染色的因素有很多，而抗體孵育條件、設置合理對照、固定液的洗脫、抗原修復和洗片等可能是做好免疫組織化學染色的關鍵注意點。

1基本原理及特點

免疫組織化學染色方法是根據免疫學中抗原抗體特異性結合，通過熒光或化學顯色檢測細胞或組織中抗原的含量和分布。免疫組織化學染色法具有特異性強、靈敏度高和定位準確等特點。目前最常用的幾種免疫組織化學染色方法主要包括免疫熒光法、免疫酶標法和免疫膠體金技術等。免疫熒光法是將熒光素標記的二抗和一抗結合，可在熒光顯微鏡下直接觀察細胞或組織內相應抗原的表達和分布。免疫酶標法與免疫熒光法不同之處在于二抗的標記方式，它用酶標二抗代替熒光素標記的二抗，然后通過加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，然后通過光鏡或電鏡，觀察細胞或組織內抗原的含量和分布。免疫酶標法包括二步法、ABC法、SP三步法等多種方法，由于其組織形態較為完整，在抗原定位上對免疫熒光法具有更大的優勢。

2幾個關鍵注意點

2.1抗體孵育條件 抗體孵育是免疫組織化學染色中最關鍵的步驟，也是最核心的步驟。一個失敗的免疫組化實驗結果大部分都與抗體孵育條件不佳有關。抗體孵育條件包括抗體稀釋濃度、孵育時間和溫度、抗體稀釋液等因素。即便是同一個抗原，在不同組織中表達豐度也有很大的差異，因此一定要根據濃度梯度選擇合適的抗體稀釋濃度。一抗孵育溫度包括4℃、室溫和37℃，4℃反應較為溫和，效果最好。一般可選擇4℃過夜，然后37℃復溫30min～1h。二抗孵育條件一般室溫2h。室溫一般定義為25℃，如果在夏天或冬天選擇室溫孵育，需要注意室溫的溫度。可以用添加5%二抗來源血清的PBS稀釋抗體，如果抗原位于細胞質或細胞核，建議用含5%二抗來源血清的TBST稀釋抗體。由于弱堿性條件有利于抗原抗體結合，因此一定要注意抗體稀釋液的PH值在7.2～7.4之間。此外，為了防止抗原抗體反應時液體的蒸發，可在擦干組織周圍的液體后，使用免疫組化筆在組織周圍畫圈，使抗體不易流失，抗原抗體的反應過程中不干片，保證結合效率。

2.2設置合理對照 由于免疫組織化學染色中影響抗原和抗體結合的因素很多，因此必須設置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照包括：陽性對照、陰性對照和空白對照等。陽性對照是用已證實含用待測抗原的組織進行同樣操作，結果應為陽性。通過陽性對照可排除染色步驟以及所用的試劑的問題。用確知不存在待檢抗原的組織切片染色為陰性對照，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的\"假陽性\"結果。空白對照是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的的非特異性顯色或熒光。

2.3固定液的洗脫 取材新鮮、固定及時，不僅可保存組織細胞形態結構的完整，而且可保留組織細胞的抗原性。固定液的選擇將直接影響免疫組化標記的結果及病理診斷的準確性[1]。然而，因固定液滲到組織中，所以必須徹底沖洗，除去固定液，否則會影響下一步的脫水和染色。由于免疫組織化學染色需要組織保存較高的抗原活性，因此一般選用PBS對固定的組織進行浸洗，30min/次，連續浸洗3次。

2.4抗原修復固定和石蠟包埋 可使組織部分抗原決定簇與核酸或其他蛋白發生交聯，如果不進行抗原修復可能會得到\"假陰性\"實驗結果。常用的修復方法包括高壓修復、微波處理法和酶消化法等。通過微波抗原修復，充分暴露抗原決定簇，有利于抗原抗體結合，提高實驗結果的準確性。一般可用微波中火修復4次，5min/次，抗原修復液需預熱至修復時所需的溫度。在微波修復過程中，應注意抗原修復液的蒸發，必須保證組織浸于液面以下，否則易造成假陰性結果。如果液體蒸發較多，可在中間及時加入預熱的抗原修復液。微波修復后需自然冷卻至室溫，一般需要30min～1h。抗原修復液的pH值對染色結果有很大影響[2，3]。抗原修復液一般采用酸性的檸檬酸修復液，酸性pH值的抗原修復液效果要好于堿性修復液，并且不易造成脫片。此外，丙酮簡單處理標本是一種方法簡單、又能使組織免疫反應活性得到明顯加強的方法，有時可替代復雜的抗原修復技術[3]。

2.5洗片 一般來說可用PBST在搖床上浸洗3次，10min/次，具體浸洗時間和次數可根據染色背景進行調整。前面已提到，弱堿性條件有利于抗原抗體結合，因此也要要注意切片漂洗液的pH值應在7.2～7.4。對于干片對染色結果的影響，余光銀等[4]發現，在沖洗步驟造成的干片，對染色結果無明顯影響；而滴加抗體和抗原修復時需防止干片，否則易造成假陰性及背景染色。

影響免疫組織化學染色結果的因素有很多，除了以上幾點需要特別關注的地方外，還有其他步驟或細節都要注意，比如組織低溫固定和脫水、固定液的選擇、石蠟切片的烤片溫度和時間、切片的低溫保存等每個細節都會影響免疫組織化學染色結果的好壞。

參考文獻：

[1]周會芹，楊江輝，余琦，等.不同組織固定液對免疫組化結果的影響[J].診斷病理學雜志，2009，16（6）：478.

[2] Shi SR， Cote RJ， Taylor CR. Antigen retrieval immunohistochemistry： past， present， and future[J]. J Histochem Cytochem， 1997， 45（3）：327-43.

[3]陳余明，張聲，王行富，等.不同的抗原修復方法在IV型膠原免疫組化染色中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2014，30（1）：98-100.

[4]余光銀，陳耀麗，蔡廣玲，等.干片對免疫組化染色結果的影響[J].臨床醫學工程，2010，17（4）：45-47.

編輯/孫杰