NR2F2在鼻咽癌中的表達及其臨床意義

摘要：目的 觀察NR2F2基因的表達與鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的關系。方法 采用實時定量rtPCR技術檢測NR2F2基因在NPC細胞株（CNE1、CNE2、58F）和鼻咽上皮細胞株（NP69）中的表達；采用組織芯片技術通過免疫組化檢測NR2F2在124例惡性鼻咽癌腫瘤、31例對應的癌旁正常組織和12例正常鼻炎粘膜組織的表達。結果 NR2F2 mRNA在NP69中表達水平較高，而在NPC細胞株中表達水平顯著下降。正常鼻咽粘膜及癌旁組織中NR2F2蛋白染色陽性表達率約為72% （31/43）；而在鼻咽癌組織中陽性表達率約為31% （39/124）；NR2F2蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負相關（P<0.01），與頸淋巴結轉移（N）無關（P>0.05）。結論 NR2F2基因表達的抑制可能參與鼻咽癌的發生。

關鍵詞：NR2F2；鼻咽癌；基因表達

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方較高發的惡性腫瘤，嚴重危害公眾健康。其病因目前尚不明確。患者初診時常伴有頸部淋巴結轉移，因此急需尋找能用于鼻咽癌早期診斷以及預后的生物標志物，為早期診斷和治療提供線索。

NR2F2是1991年被識別的一個配體依賴性轉錄因子，為類固醇/甲狀腺激素核受體家族中的一個新成員[1]。多項研究表明NR2F2可參與調節多個不同基因的表達，在控制組織和器官發育的過程中發揮重要作用[2-3]。近來有研究報道NR2F2在激素抵抗型乳腺癌細胞中表達受抑制，且該基因的表達與腫瘤組織分型呈負相關[4-5]，表明NR2F2表達下調可能參與腫瘤發生。

本研究通過對鼻咽癌細胞株和鼻咽上皮細胞株的NR2F2基因mRNA表達水平的檢測并利用組織芯片配合免疫組化觀察NR2F2蛋白表達在鼻咽癌組織和正常及癌旁組織的差異，探討了NR2F2的表達與鼻咽癌之間的關系及其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料 Trizol 試劑購自Invitrogen公司； 反轉錄酶購自 TaKaRa 公司；熒光定量PCR MIX（SYBR染料法）購自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培養基購自 Gibco 公司；組織芯片NPC961和NPC962購自西安艾麗娜生物科技有限公司；兔抗人NR2F2抗體（ab50487）購于 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購于碧云天生物公司。

1.2細胞培養 三株鼻咽癌細胞CNE1、CNE2、58F和一株鼻咽上皮細胞NP69由中山大學腫瘤中心康鐵邦教授惠贈；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基在 5% CO2、37 ℃培養箱內培養。

1.3 rt-PCR 檢測NR2F2 mRNA 的表達 Trizol 提取總RNA，采用反轉錄酶（TaKaRa）按說明書合成cDNA。PCR 擴增引物由華大生物技術有限公司合成： NR2F2基因引物上游： 5'- CCATAGTCCTGTTCACCTC -3'，下游： 5'- GCTCCTAACGTATTCTTCCA -3'，產物長度104bp； actin引物上游： 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT -3'，下游： 5'-GCTGTCACCTTCACCTTTCC -3'，產物長度268 bp。采用20 μL的反應體系，每個樣本重復3次，求平均Ct值作為實驗結果。反應過程具體為： 95℃預變性3 min；95℃變性13 s，59℃退火和延伸45 s，擴增40個循環。計算ΔCT=Ct（NR2F2）-Ct（actin）；再根據ΔΔCT=ΔCT（腫瘤細胞株）-ΔCT（NP69），進一步計算NR2F2在腫瘤細胞株與NP69之間表達倍數的差異。

1.4組織芯片及免疫組化分析 組織芯片NPC961和NPC962包含124例原發性鼻咽癌腫瘤、31例對應的癌旁正常組織和12例正常鼻炎粘膜組織。組織芯片經二甲苯脫石蠟，乙醇再水化，PBS清洗，至于0.01 M檸檬酸緩沖液（pH 6.0）在微波爐中加熱使抗原復活，3% H2O2中室溫浸泡10min封閉內源性過氧化物酶活性，抗-NR2F2于4℃孵育過夜，滴加二抗工作液，DAB顯色劑顯色，蘇木精復染后，中性樹膠封片，于普通顯微鏡下觀察。

1.5統計學分析 計數資料相關性分析及率的比較用Pearson's χ2檢驗或Fisher's精確檢驗（SPSS 19.0版統計軟件）。

2結果

2.1 NR2F2在鼻咽癌細胞株中的表達 為了比較NR2F2在鼻咽癌細胞和正常細胞間的表達差異，我們分別利用實時定量rt-PCR比較了高分化型鼻咽癌細胞株CNE1、低分化型鼻咽癌細胞株CNE2、高轉移型鼻咽癌細胞株58F和鼻咽上皮細胞株NP69中NR2F2的mRNA表達水平。結果表明，在正常鼻咽上皮細胞株NP69中NR2F2的mRNA表達水平較高，而在三種鼻咽癌細胞株中表達水平均顯著下降，見圖1。

2.2 NR2F2蛋白在組織中的表達及與臨床病理因素的關系 鼻咽癌組織中NR2F2蛋白染色主要位于細胞核內，呈棕黃色，見圖2。在43例正常鼻咽黏膜及癌旁組織中有31例為明顯NR2F2蛋白染色，陽性表達率約為72%；而在124例鼻咽癌組織中則有39例為NR2F2蛋白染色陽性， 陽性表達率約為31%；正常及癌旁組織中的NR2F2蛋白陽性率明顯高于鼻咽癌組織（P<0.01），見表1。NR2F2蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負相關（P<0.01），與頸淋巴結轉移（N）無關（P>0.05），見表2。

3結論

類固醇/甲狀腺激素核受體家族成員已經在許多物種中被克隆并廣泛表達于各種組織[6]。在胚胎發育、細胞分化過程中有著重要的作用。人轉錄因子NR2F2，也稱為COUP-TFII，定位于15q26.2，包含414個氨基酸的蛋白質，具有兩個典型的半胱氨酸類鋅指結構作為DNA結合域。研究表明NR2F2在卵巢癌、子宮內膜癌和乳腺癌等幾種癌癥的發生發展過程中起著重要作用[7- 8]，但具體過程仍不清楚。

我們通過實時定量rtPCR檢測三種鼻咽癌細胞株（CNE1、CNE2、58F）和鼻咽上皮細胞株（NP69）中NR2F2基因mRNA的表達，發現相對于NP69細胞株，CNE1、CNE2和58F細胞株中NR2F2基因mRNA表達顯著下降，提示NR2F2基因表達抑制可能與鼻咽癌發生有關。Krista等在乳腺癌中發現了相似的結果，并提出COUP-TF低表達可能促進它莫西芬（TAM）（一種抗雌激素）抵抗及乳腺癌發生的假設，他們利用siRNA技術干擾COUP-TFII（即NR2F2）在乳腺癌細胞中的表達，發現當COUP-TFII表達下降時會降低4-OHT 和ICI 182，780對乳腺癌細胞生長抑制的作用；相反，當通過穩定轉染提高COUP-TFII表達則可抑制TAM抵抗性乳腺癌細胞的增值[4]。這些結果都表明NR2F2表達抑制可能與腫瘤發生有關。

我們的研究發現，NR2F2在31%（39/124）的鼻咽癌組織中有表達。在正常的鼻咽上皮組織及癌旁組織中，NR2F2蛋白為72%（31/43）的陽性表達率，表明相對于正常組織而言，NR2F2蛋白在鼻咽癌組織中表達受到抑制。這種差異表達提示NR2F2蛋白在鼻咽癌的發生中可能具有一定的作用。進一步與臨床病理因素的相關分析發現NR2F2蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負相關（P<0.01）。Lacey等利用乳腺癌組織芯片免疫組化分析發現在TNM分期中處于II期和II～III期的乳腺癌組織COUP-TFII著色有顯著差異。332例乳腺癌樣本中約有47%的樣本細胞核中COUP-TFII呈陽性；COUP-TFII的表達與乳腺癌腫瘤分級顯著相關，高分級的樣本中COUP-TFII的表達趨向于陰 性[9]。由此可以推斷NR2F2的表達水平可以反映腫瘤細胞的增值程度與分化狀態。

綜上所述，本研究通過比較鼻咽癌細胞株和鼻咽上皮細胞株中NR2F2基因的mRNA表達水平的差異，發現該基因的表達在鼻咽癌細胞株中存在較為顯著的表達抑制。組織芯片免疫組化結果發現NR2F2蛋白在腫瘤組織中表達率顯著低于在正常組織和癌旁組織中的表達率且NR2F2蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍（T）呈負相關。以上結果表明NR2F2基因表達的抑制可能參與鼻咽癌的發生。

參考文獻：

[1]Ladias JA， Karathanasis SK： Regulation of the apolipoprotein AI gene by ARP-1， a novel member of the steroid receptor superfamily [J]. Science，1991，251：561-565.

[2]Pereira FA， Qiu Y， Zhou G， et al.The orphan nuclear receptor COUP-TFII is required for angiogenesis and heart development [J]. Genes Dev，1999，13：1037-1049.

[3]Lee CT， Li L， Takamoto N， et al.The nuclear orphan receptor COUP-TFII is required for limb and skeletal muscle development [J]. Mol Cell Biol，2004， 24：10835-10843.

[4]Riggs KA， Wickramasinghe NS， Cochrum RK， et al.Decreased chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II expression in tamoxifen-resistant breast cancer cells [J]. Cancer Res，2006， 66：10188-10198.

[5]Muscat GE， Eriksson NA， Byth K， et al.Research resource： nuclear receptors as transcriptome： discriminant and prognostic value in breast cancer [J]. Mol Endocrinol， 27：350-365.

[6]Kieback DG， Runnebaum IB， Moebus VJ， et al.Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor （COUP-TF）： an orphan steroid receptor with a specific pattern of differential expression in human ovarian cancer cell lines [J]. Gynecol Oncol，1993， 51：167-170.

[7]Nakshatri H， Mendonca MS， Bhat-Nakshatri P， et al.The orphan receptor COUP-TFII regulates G2/M progression of breast cancer cells by modulating the expression/activity of p21（WAF1/CIP1）， cyclin D1， and cdk2 [J]. Biochem Biophys Res Commun，2000， 270：1144-1153.

[8]Kieback DG， Levi T， Kohlberger P， et al.Chicken ovalbumin upstream promoter--transcription factor （COUP-TF） expression in human endometrial cancer cell lines [J]. Anticancer Res，1996， 16：3371-3376.

[9]Litchfield LM， Riggs KA， Hockenberry AM， et al.Identification and characterization of nucleolin as a COUP-TFII coactivator of retinoic acid receptor beta transcription in breast cancer cells [J].PLoS One，7：38278.

編輯/張燕