miR—200b抑制人舌癌Tca8113細胞生長與侵襲

摘要：目的 探討miR-200b對人舌癌Tca8113細胞的生物學功能。方法 運用MTT法、細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗檢測miR-200b對人舌癌Tca8113細胞的生長、遷移和侵襲能力。結果 MTT檢測發現，過表達miR-200b可抑制人舌癌Tca8113細胞的生長，具有時間依賴性；細胞劃痕實驗顯示，轉染miR-200b模擬物48 h后傷口愈合率為（56.47±3.18%）與對照組（92.26±2.31%）比能明顯減緩Tca8113細胞劃痕傷口的愈合，差異有統計學意義（P<0.01）；Transwell侵襲實驗顯示，轉染miR-200b模擬物36h后穿過基底膜的細胞數為（76±5）與對照組（182±11）比能明顯減緩Tca8113細胞侵襲能力，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 miR-200b可抑制人舌癌Tca8113細胞生長與侵襲。

關鍵詞：miR-200b；舌癌；生長與侵襲

microRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA小分子，通過與靶基因mRNA的3'UTR區域完全或不完全結合，從而調控相關靶基因的表達[1]。目前miR-200b在腫瘤中的研究如火如荼，在多種惡性腫瘤中，如在胃癌、乳腺癌、膠質瘤以及非小細胞肺癌中表達下調，類似抑癌基因樣作用[2-5]。然而目前關于miR-200b在舌癌中的表達情況以及生物學功能尚未見任何文獻報道。本研究采用MTT，劃痕實驗，transwell侵襲實驗首次分析miR-200b在人舌癌Tca8113細胞中的生物學功能，為進一步探討舌癌發生發展的分子機制提供實驗依據。

1實驗方法

1.1 MTT法 消化培養瓶中預先培養的舌癌Tca8113細胞，收集離心并計數，取200 μL即5×103個細胞接種于96孔板中，設復孔6個，置于細胞培養箱中培養24～48 h后取出，每孔加入滅菌MTT液（5 mg/mL）20 μL，培養箱中繼續孵育4 h。再加入150 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min，選擇570 nm波長，酶標儀測定各孔吸光度值，記錄結果，實驗重復3次。

1.2劃痕實驗 將舌癌Tca8113細胞接種于6孔板中培養，待長至臨近飽合。用無菌10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，于倒置顯微鏡下分別觀察各組細胞0 h，24 h，48 h的劃痕距離，并攝像。軟件測量各孔細胞任意3個部位的不同劃痕距離，并計算各組傷口愈合率，計數三組實驗的平均值，并進行統計分析。

1.3 Transwell侵襲實驗 在8 um的transwell小室中鋪加50 μL基質膠稀釋液，放置于37℃培養箱中，過夜以成膜，取100 μL即每孔1×105個細胞/mL接種至transwell小室的上腔，另下腔中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液500 μL。置于培養箱中培養36 h。取出transwell小室，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶祡染色。光學顯微鏡下觀察并攝相，隨機選取4個視野進行細胞計數，取平均值，實驗重復3次。

1.4統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，當P<0.05時，為差異有統計學意義。

2實驗結果

2.1 MTT法檢測miR-200b對人舌癌Tca8113細胞生長的影響 為確定外源性高表達miR-200b對舌癌Tca8113細胞增殖的作用，將miR-200b模擬物轉染于Tca8113細胞中，轉染miRNA的無關序列用于陰性對照。轉染miR-200b模擬物48 h、72 h、96 h后，舌癌Tca8113細的增殖能力顯著抑制，對照組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。表明高表達miR-200b能明顯抑制舌癌Tca8113細胞增殖。

2.2劃痕實驗檢測miR-200b對人舌癌Tca8113細胞遷移能力影響 劃痕結果顯示，轉染miR-200b模擬物48h后傷口愈合率分別為（56.47±3.18%）與對照組（92.26±2.31%）比較明顯減緩，差異均有統計學意義（P<0.01）。表明高表達miR-200b能明顯抑制舌癌Tca8113細胞的遷移能力。

2.3 Transwell侵襲實驗檢測miR-200b對人舌癌Tca8113細胞侵襲能力的影響。Transwell結果顯示，轉染miR-200b模擬物36 h后穿過基質膠的細胞數量分別為（76±5），與對照組（182±11）相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。表明高表達miR-200b能明顯抑制舌癌Tca8113細胞的侵襲能力。

3討論

舌癌是常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，大約占口腔惡性腫瘤的50%～60%左右，全球每年約50萬人死于舌癌[6]，嚴重威脅著人類的生命。近年來，舌癌的發病率不斷上升，且與其它頭頸部惡性腫瘤相比，該病具有發展快，轉移早以及預后差等特點[7]。

迄今為止，在人類共發現大約1，872種miRNA前體和2，578種成熟miRNA的存在，并且在真核生物中廣泛表達。miRNA基因位于蛋白編碼基因的內含子或外顯子區。許多miRNA序列在進化上非常保守，這意味著miRNA在人類的進化和生理學中扮演著重要角色。根據生物軟件的預測，每個miRNA可能調控上百個靶基因，大約調控人類1/3的蛋白編碼基因的表達。

miR-200b有兩個染色體位點，分別是miR-200b-1位于3號染色體CTDSPL基因內含子和miR-200b-2位于12號染色體CTDSP2內含子。Tang等[2]研究表明，miR-200b在胃癌組織和不同胃癌細胞株中表達下調，通過靶向Wnt-1通路抑制人胃癌MGC-803細胞的生長并可誘導胃癌細胞發生凋亡。Li等[8]研究顯示，miR-200b在鼻咽癌組織和細胞中表達下調，并通過靶向EZH2基因可抑制鼻咽癌細胞的增殖和致瘤性。上述研究表明miR-200b是一個抑癌miRNA。鑒于此，我們在本次實驗中，對miR-200b在舌癌中研究將可能進一步明確其在舌癌中的生物學作用。通過MTT，細胞劃痕，Transwell等細胞生物學實驗證實了miR-200b可抑制人舌癌Tca8113細胞生長、遷移和侵襲的作用，并初步確定miR-200b在舌癌中發揮抑瘤基因樣作用。繼續深入miR-200b在舌癌中的研究，闡明miR-200b參與舌癌發生發展的分子機制，為舌癌的防治提供理論依據和實驗基礎。

參考文獻：

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[8]Lu J， He ML， Wang L， et al. MiR-200b inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J].Cancer Res，2011， 71：225-233.

編輯/肖慧