市售正清風(fēng)痛寧腸溶片在Beagle犬體內(nèi)的相對(duì)生物等效性

摘要：目的探討正清風(fēng)痛寧腸溶片在Beagle犬體內(nèi)的相對(duì)生物等效性。方法選用10只Beagle犬單劑量隨機(jī)交叉口服正清風(fēng)痛寧腸溶片受試制劑或參比制劑10mg·kg-1，用高效液相色譜法測(cè)定血藥濃度，3p97軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和并行相對(duì)生物等效性評(píng)價(jià)。結(jié)果受試制劑與參比制劑的藥-時(shí)曲線呈一室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax分別為（86.25±10.61）min和（75.00±16.04）min，Cmax分別為（0.18±0.038）ug·ml-1和（0.18±0.042）ug·ml-1，AUC 0～T分別為（30.31±7.82）ug·min·ml-1和（32.09±8.61）ug·min·ml-1，受試制劑相對(duì)生物等效性為（94.45±5.49）%。結(jié)論經(jīng)方差分析、單雙側(cè)t檢驗(yàn)和非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，表明受試制劑與參比制劑具有生物等到效性。

關(guān)鍵詞：正清風(fēng)痛寧腸溶片；高效液相色譜法、相對(duì)生物等效性

正清風(fēng)痛寧腸溶片具有抗炎抗風(fēng)濕、免疫抑制、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的作用，已廣泛應(yīng)用于臨床[1]。該制劑的主要成份是從傳統(tǒng)治療風(fēng)濕性疾病中藥清風(fēng)藤提取的一種單體成分青藤堿（sinomenine）。有關(guān)青藤堿的藥動(dòng)學(xué)已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，但其市售不同廠家腸溶片在Beagle犬體內(nèi)的相對(duì)生物等效性未見文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下，供臨床醫(yī)生參考。

1資料與方法

1.1儀器Angilent1100高效液相色譜儀，Phenomenex Gemini C18色譜柱（4.6mm×250mm，5um）；VXH-3型快速混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PHS-3C酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；B160A型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠）；BP61型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2藥品和試劑①受試制劑，西安利君制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的正清風(fēng)痛寧腸溶片（商品名為正清風(fēng)痛寧片），規(guī)格：20mg/片，批號(hào)0707291。②參比制劑，湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的的正清風(fēng)痛寧腸溶片，規(guī)格：20mg/片，批號(hào)0803103。③青藤堿標(biāo)準(zhǔn)品，外觀為白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭，味苦，易溶于水，溶解于乙醇，純度98%，西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)20070402。④內(nèi)標(biāo)物，去水嗎啡，規(guī)格：5mg：1ml，沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)20020613。⑤二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純。 ⑥重蒸水（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科）。

1.3動(dòng)物合格Beagle犬10只，體重（10±0.8）kg，雌雄各半，四川養(yǎng)麝研究所提供，質(zhì)量合格證號(hào)和環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)SCXK(川)2008-01。

1.4方法

1.4.1給藥方案與血樣采集選擇用10只Beagle犬，雌雄各半，隨機(jī)分為受試制劑和參比制劑兩組，每組5只，分別口服受試制劑或參比制劑，1w后兩組動(dòng)物交叉給藥，給藥劑量為試驗(yàn)前禁食12h后，按人與動(dòng)物用量轉(zhuǎn)換[4]，于次日8時(shí)空腹灌服受試制劑或參比制劑10.0mg·kg-1，于給藥后0，15，30，60，90，120，240，

480min，從隱靜脈取血2ml，肝素抗凝，分離血漿，低溫保存（-20℃）待測(cè)。

1.4.2血藥濃度測(cè)定方法

1.4.2.1色譜條件 PhenomenexGeminiC18色譜柱（4.6mm×250mm，5um），流動(dòng)相為甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氫鈉-三乙胺（55：45：0.1，調(diào)pH至7），流速0.8ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)262nm；柱溫30℃；內(nèi)標(biāo)去水嗎啡；進(jìn)樣量50ul。

1.4.2.2青藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取青藤堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇定容，配成300ug·ml-1儲(chǔ)備液，于4℃保存。用前，用犬空白血漿按所需倍數(shù)稀釋法稀釋至所需濃度，得青藤堿的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2.3內(nèi)標(biāo)液的配制取去水嗎啡液（5mg：1ml），用甲醇配為200ug·ml-1的儲(chǔ)備液，于4℃保存。臨用前，加蒸餾水稀釋成40ug·ml-1，得內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4.2.4樣品處理取血漿樣品0.4ml，加入去水嗎啡內(nèi)標(biāo)50uL（40ug·ml）混合均勻，再行加入二氯甲烷4ml，漩渦混勻后置3500r·min-1離心機(jī)離心5min，等待靜置分層，取有機(jī)層，置50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑昧鲃?dòng)相復(fù)溶100uL，每次進(jìn)樣50uL。

1.5數(shù)據(jù)處理藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算是采用3p97計(jì)算機(jī)軟件。所得Cmax、Tmax用實(shí)測(cè)值表示；AUC0～T 用梯形法計(jì)算，口服給藥的生物利用度 F=受試制劑（AUC0～T）/參比制劑（AUC0～T）×100%

2結(jié)果

2.1特異性在選定的色譜條件下，青騰堿和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰形好，與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)分離良好，見圖1，圖A，B，C，D分別為青騰堿+去水嗎啡對(duì)照品溶液，空白血漿，空白血漿+青騰堿+去水嗎啡對(duì)照品，Beagle犬給藥1h后血漿樣品。

圖1青騰堿HPLC圖

A青騰堿+去水嗎啡對(duì)照品溶液；B.空白血漿；C.空白血漿+青騰堿+去水嗎啡；D.給藥品1h后血漿樣品[1.青騰堿;2.去水嗎啡（內(nèi)標(biāo)）]

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和最低定量濃度分別取青騰堿標(biāo)準(zhǔn)溶液適量和犬空白血漿，配制質(zhì)量濃度為0.0075，0.045，0.45，4.5，22.5，45，90ug·ml-1 的青騰堿血漿樣品，按1.4.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理并進(jìn)樣分析，所得數(shù)據(jù)以血漿中青騰堿的濃度X對(duì)青騰堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值Y進(jìn)行線性回歸，得血漿中青騰堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.3920X+0.7052（r=0.9991）。結(jié)果表明，青騰堿檢測(cè)濃度在0.0075～90 ug·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量濃度為0.0075ug·ml-1(n=5，RSD=9.23%)。

2.3回收率和精密度取青騰堿回收液適量及犬空白血漿，制成高、中、低3種不同濃度（45，4.5，0.045ug·ml-1）樣品，按1.4.2.4項(xiàng)下方法處理，評(píng)價(jià)本法的方法，回收率與萃取回收率（含藥血漿經(jīng)樣品處理所得測(cè)定值與同時(shí)用流動(dòng)相配制的同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定值，計(jì)算萃取回收率）及日內(nèi)（每個(gè)濃度1d內(nèi)測(cè)定5次）、日間精密度（每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)5d，測(cè)1次/d），見表1。

2.4穩(wěn)定性

2.4.1室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)取中濃度（4.5ug·ml-1）血漿樣品，室溫放置，于24h內(nèi)測(cè)定3次，結(jié)果表明室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好（青騰堿：4.42±0.20 ug·ml-1，RSD=4.52%）。

2.4.2冷藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取中濃度（4.5ug·ml-1）血漿樣品，冷藏(4℃)放置，于6d內(nèi)測(cè)定5次，結(jié)果表明冷藏放置6d內(nèi)穩(wěn)定性良好（青騰堿：4.68±0.23 ug· ml-1，RSD=4.91%）。

2.4.3凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)將含藥血漿反復(fù)冷凍（-20℃）、溶解，按樣品處理后測(cè)定，3d內(nèi)測(cè)定3次，測(cè)得青騰堿質(zhì)量濃度分別為0.12，0.13，0.12ug·ml-1，結(jié)果表明血漿樣品3d內(nèi)反復(fù)凍融測(cè)定穩(wěn)定性良好（0.12±0.0058ug·ml-1，RSD=4.8%）。

2.5血漿濃度則定結(jié)果受試制劑組和參比制劑組動(dòng)物按10.0 mg·kg-1量單次口服相應(yīng)制劑后的血漿按2.2.4項(xiàng)下方法處理后，以青騰堿峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 受試制劑與參比制劑的平均藥-時(shí)曲線

2.6藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與相對(duì)生物利用度受試制劑組與參比制劑組體內(nèi)血藥濃度的藥-時(shí)數(shù)據(jù)經(jīng)擬合后均為一室開放模型，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。受試制劑的相對(duì)生物利用度為（94.45±5.49）%。

2.7生物等效性評(píng)價(jià)采用受試制劑或參比制劑組的AUC（0～T）分別計(jì)算相對(duì)生物利用度（F）[2]。受試制劑的F（94.45±5.49）%。相對(duì)生物利用度主要參數(shù)AUC（0～∞）、AUC（0-T）和Cmax經(jīng)方差分析，兩藥間無(wú)差異（P＞0.05）；雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果均等效；（1-2α）置信區(qū)間法統(tǒng)計(jì)均等效。

3討論

文獻(xiàn)報(bào)道，血漿內(nèi)青藤堿采用高效液相色譜法檢測(cè)，可選用三唑侖[3]、氯霉素[5]和氨基比林[6]作內(nèi)標(biāo)。經(jīng)分析青騰堿結(jié)構(gòu)，選擇用結(jié)構(gòu)類似物嗎啡作內(nèi)標(biāo)較為滿意；流動(dòng)相中磷酸二氫鉀換為磷酸二氫鈉，各試劑比例為甲醇：磷酸二氫鈉（55：45），結(jié)果穩(wěn)定，簡(jiǎn)單易行，操作方便，完全能滿足本研究條件。

青騰堿在家兔、Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。本研究結(jié)果所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道類似。在Beagle體內(nèi)受試制劑與參比制劑AUC（0-T）分別為30.31±7.82與32.09±8.61ug·min·ml-1，受試制劑的F為（94.45±5.49）%，與文獻(xiàn)報(bào)道相類似。試驗(yàn)結(jié)果表明，青騰堿口服易于吸收，受試制劑與參比制劑生物等效。

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編輯/申磊