原發性肝癌組織MAGE-A1和MAGE-A3蛋白表達及其生物學意義的研究

摘要：本文采用免疫組化(SP)法檢測30例HCC患者癌組織及相應癌旁組織中MAGE-A1，A3蛋白表達，并結合臨床資料進行分析。分析結果顯示MAGE-A1，A3在HCC中高表達，提示其在HCC的發生與發展中起了一定的作用，是肝癌免疫治療的可用靶向分子。

關鍵詞：肝癌，黑色素瘤抗原基因

腫瘤/睪丸抗原(cancer testis antigen，CTA)是一類腫瘤特異性抗原，因能夠引起機體對腫瘤的主動免疫[1]，成為腫瘤疫苗研究中的熱點。本研究以兩種免疫原性較強的CTA抗原黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen， MAGE)A1和A3作為免疫標志物，采用免疫組化(SP)法檢測其在原發性肝癌（HCC）組織中的表達情況，探討其作為肝癌免疫治療靶標的可行性及其與肝癌生物學行為的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年1月~2013年6月沈陽市第四人民醫院肝膽外科收治的HCC患者30例，伴有乙型肝炎病毒陽性26例。其中男女比例為2:3，年齡38~72歲，平均56.3歲。全部病例術前均無化療、放療及免疫治療史。均手術完整切除病灶，經術后病理證實，切緣均陰性。病灶切除后，先距腫瘤邊緣5cm外取癌旁組織，再切取癌組織，保存于液氮中備用，然后轉-80℃凍存備用。正常睪丸蠟塊標本作為陽性對照。

1.2實驗試劑濃縮型鼠抗人MAGE-A1單克隆抗體、鼠抗人MAGE-A3單克隆抗體、鼠抗人AFP單克隆抗體均購自Upstate公司、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.3方法 所有標本經10%的福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，4μm連續切片，分別作HE和SP染色。SP染色按試劑盒說明操作，3%雙氧水室溫孵育除去內源性過氧化物酶的活性，微波修復抗原15min，常規免疫組化標記。以正常睪丸組織作為陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。DAB顯色，蘇木精襯染，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。

1.4結果判斷及評分標準 光鏡雙盲法觀察切片中5個400倍高倍視野，細胞漿中出現棕黃色顆粒判定為免疫組化陽性染色。采用半定量積分法[2]判斷結果: 1)陽性細胞數：≤5%為0分，>5%-25%為1分，>25%~50%為2分，>50%~75%為3分，>75%為4分；2)陽性強度：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩者積分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。為減少人為因素造成的誤差，以2位病理科醫生觀察結果核對后作為最終評定結果，若判定結果相差3分則重新觀察。

1.5統計學方法使用SPSS10.0軟件建立數據庫，使用χ2檢驗和四格表確切概率法。

2結果

2.1 MAGE-A1，A3和AFP蛋白在HCC中的表達MAGE-A1，A3和AFP蛋白在正常肝癌組織中無表達，陽性表達于肝癌的細胞質。見圖1。

圖1 分別為MAGE-A1，A3和AFP蛋白在肝癌的細胞質的表達(×200)

2.2MAGE-A1，A3和AFP蛋白在HCC中的聯合表達情況30例HCC患者癌組織中MAGE-A1，A3和AFP蛋白表達的陽性率分別為40%、47%和63%，高于對照組（0%）(P<0.01)。30例HCC中，至少表達1種MAGE蛋白的為21例，表達率為70%；表達2種MAGE蛋白的為10例，表達率為33%，29例HCC患者至少表達1種蛋白，表達率為96.7%。MAGE-A1/AFP蛋白陽性表達的為10例，表達率為33.3%。MAGE-A3/AFP蛋白陽性表達13例，表達率為43.3%。MAGE-A1，A3/AFP蛋白陽性表達8例，表達率為26.7%。

2.3MAGE 蛋白表達與臨床指標的關系30例HCC中MAGE-A1，A3蛋白表達的陽性率與患者性別、年齡、有無包膜以及乙型肝炎病毒感染等指標無關(P>0.05)，與腫瘤大小及AFP水平相關(P<0.05)。

3討論

目前，肝癌的治療仍以手術切除結合放、化療為主，術后常見轉移與復發，因此，針對腫瘤特異性抗原的免疫治療已成為臨床治療研究的熱點。CTA已經被認為是目前免疫原性最強的腫瘤抗原之一。

國內外研究多采用RT-PCR的方法檢測CTA基因的表達，蛋白水平的研究尚不多。本研究顯示，30例HCC患者癌組織中MAGE-A1，A3蛋白均有較高表達，70%至少表達1種MAGE蛋白。聯合AFP檢測后，96.7%的HCC患者至少表達1種蛋白，遠高于單一檢測AFP的表達率。對比臨床資料發現MAGE-A1，A3蛋白表達與患者年齡、性別、病毒感染和有無完整包膜等均不相關，而MAGE- A1，A3蛋白表達與患者腫瘤大小及AFP水平均存在相關性，這就提示我們檢測血清中MAGE-A1，A3蛋白特異性抗體的表達，就有可能作為HCC的輔助診斷指標之一，尤其是在AFP陰性表達的HCC患者中有可能作為腫瘤標志物。

綜上所述，MAGE-A1和A3在肝癌中的高水平表達，為進一步研究MAGE在肝癌的分子診斷和免疫靶向治療提供了依據。

參考文獻：

[1]Scanlan MJ，Gure A O，Jnnghlnth A A，et al.Cancer/ testis antigens:an expanding family of targets for cancer immunotherapy[J].Immunological Reviews，2002，188:22-32.

[2]Clark E A，Brugge J S.Integrins and signals transduction pathways:the road taken[J].Science，1995，268(2):233-239.

編輯/王海靜