小鼠單核巨噬白血病細胞培養條件優化

摘要：目的探討小鼠單核巨噬白血病細胞的細胞培養方法。方法采用胰酶消化和細胞刮棒的方法獲得細胞最適的傳代方法，比較培養基酸堿度、培養耗材等確定最佳培養條件。結果采用細胞刮棒方法，沿著細胞培養瓶一端順勢往另一端輕柔刮取細胞比胰酶消化法獲得的細胞傳代，對細胞的損傷更小，細胞狀態更好，在所有細胞培養條件中，培養耗材的高壓滅菌和培養基的酸堿度對細胞的影響最大，在培養過程中需要采取180℃高壓滅菌和調節酸堿度來獲得細胞的最佳狀態。結論采用DMEM高唐培養基+10%FBS，細胞刮棒沿著一個方向輕輕刮取細胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過濾的HEPES每次實驗時調節培養基酸堿度，是細胞的最佳培養條件。

關鍵詞：小鼠單核巨噬白血病細胞；細胞刮棒；高壓滅菌；酸堿度

細胞培養技術是目前很多醫學研究離不開的技術，腫瘤細胞在細胞培養中占據核心的地位。腫瘤是對人類威脅最大的疾病之一，是研究癌變機制和抗癌藥物篩選的重要手段。腫瘤細胞雖具有無限增殖的特性，但并不表示培養起來很容易，很多因素都會影響到細胞的形態及功能。如：酸堿度、CO2濃度、環境溫度等。小鼠單核巨噬白血病細胞（RAW264.7）是炎癥研究中非常常見的研究對象，炎癥是伴隨多種疾病的并發癥，因此越來越受到重視。本文根據實踐經驗，總結RAW264.7細胞在培養過程中的生活特性及影響因素，為細胞科研工作提幫助。

1 RAW264.7細胞研究

RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞，該細胞株由Raschke WC等建立。它來自Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤[1]。據知網上不完全統計，可以發現我國從1986年就已經有對 RAW264.7細胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趨勢，見圖1，可見RAW264.7細胞研究越來越受到重視，因此對于RAW264.7細胞的培養需一個規范化的標準。

圖1 RAW264.7細胞研究趨勢

2 RAW264.7細胞的培養

RAW264.7是破骨前體細胞，因此在培養過程中很容易分化形成破骨細胞，另外 RAW264.7細胞也是一種巨噬細胞，具有很強的黏附和吞噬抗原的能力，很容易將外界環境中抗原吞噬，而發生分化，出現偽足現象，這是困擾科研工作者的一個難題。因此對RAW264.7細胞的培養也是一個很長時間摸索的過程。正常的RAW264.7細胞是圓形透亮的，而分化之后很容易產生觸角，此時細胞已經在功能上發生改變，進而影響實驗結果。在我國很多細胞庫給購買者的建議是用0.25%的胰酶消化，因此我們采取了用0.25%的胰酶消化法來進行培養，發現用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的將細胞消化下來，但是對細胞的損傷很大，細胞傳代之后在培養瓶中很難貼壁，很少貼壁的細胞，細胞棱廓也變得模糊不清，細胞再也很難恢復之前的狀態。根據很多培養RAW264.7細胞的科研工作者的經驗，認為RAW264.7細胞很難用0.25%的胰酶消化這一說法，一直困惑著我們。提示這種反差的現象也許跟胰酶的純度有關。于是我們改用細胞刮棒的方法進行傳代，發現細胞狀態損傷較小，細胞在傳代2~4 h內基本貼壁，且細胞狀態完好。具體方法是沿著細胞壁的一端順勢往另一端刮，力度要輕柔，能夠將細胞刮掉即可。這里強調一定要輕，細胞是個很脆弱的個體，力度過大對細胞會造成物理損傷，嚴重時不能恢復其正常形態。對于RAW264.7細胞培養使用的培養基很多經驗者建議使用1640，中科院上海細胞庫則建議使用DMEM高糖培養基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用國產杭州四季清。因此我們對培養基和胎牛血清（FBS）的使用進行了正交實驗，研究發現DMEM高糖培養基與GIBCO胎牛血清培養的細胞狀態最好，但對于資金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培養基與國產杭州四季清進行培養，1640則需與GBICO胎牛血清配合使用，這樣才能保證細胞狀態圓而透亮。關于FBS是否滅活則需要根據你所買的FBS是否含有對細胞刺激較大的抗原決定，如有些杭州四季清含有低內毒素，內毒素是引起巨噬細胞炎癥反應的激動劑[3]，此時我們則需滅活，因此在購買血清時應盡量避免含有這類抗原的血清。血清購買回來需及時分裝，分裝需在無菌條件下操作，然后置于-20℃保存。下面根據對RAW264.7培養研究，將細胞復蘇，細胞傳代以及細胞凍存的要點歸納如下。

2.1細胞復蘇 從液氮罐中取出凍存管，迅速將凍存管放到已經預熱的水浴鍋（37℃）中迅速解凍，不斷的搖動，待凍存管內液體完全溶解（控制在1 min內），取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內，將凍存管內的液體轉入15 mL離心管，加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養基，800 rpm離心3 min，棄去上清液，重懸細胞，接種到培養瓶中，37℃，5%CO2條件下培養，此時重點是細胞凍存本來就是對細胞的損傷，需采用的是20%的胎牛血清進行復蘇培養，第二次傳代后換成10%FBS培養。

2.2細胞傳代 待細胞長至80%~90%時，從培養箱內取出細胞，小心吸出培養液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培養基，用細胞刮棒沿一個方向輕輕的將細胞刮下來，將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，800 rpm離心3 min，棄去上清液，加入培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液，分裝入培養瓶后，放入培養箱37℃，5%CO2條件下培養，因為RAW264.7細胞的增殖非常快，因此傳代比例根據自己實驗需要1∶3~1∶10均可。

2.3細胞凍存 待細胞長至80%~90%時，按細胞傳代方法把細胞收集起來，將配制好的凍存液加入細胞中重懸，每管2 mL，凍存液的配制方法是：胎牛血清與二甲基亞砜（DMSO）的比例為9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中過夜，第2 d轉移至液氮灌中保存。

3影響RAW264.7細胞培養的因素

3.1培養基酸堿度 根據對RAW264.7的培養研究發現酸堿度對于RAW264.7細胞的培養影響最大，GBICO的DMEM建議在配制過程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海細胞庫建議加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL調pH至7.2～7.4，過濾分裝置在4℃冰箱備用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培養基就很容易變紫，但是很多研究者并沒有在意這個問題，仍然用變紫的培養基繼續培養，之后細胞就會出現漂浮或者變成梭形。文獻提示可采用HEPES法進行緩沖[4]，我們研究發現雖然HEPES緩沖能力更強，培養基變堿的時間會延長，但放置時間久后仍然會變紫，通過比較可采用將HEPES配置成母液，過濾并分裝，然后每次傳代的時候用HEPES調節培養基，將培養基調至所需的pH。

3.2培養耗材 RAW264.7細胞是一類巨噬細胞，因此對于接觸細胞的培養耗材如：槍頭、培養皿等要求需要高一些，研究發現高溫180℃烘干的耗材比120℃高壓滅菌的耗材培養的細胞，細胞的形態更圓更亮，提示盡量減少抗原有助于RAW264.7細胞的培養，這與方瑤等研究發現相一致[5]。

4結論

RAW264.7細胞的培養和研究已然成為一個趨勢，對于RAW264.7細胞的培養也需要標準化的方法，本實驗研究發現RAW.264.7細胞的最佳優化條件即：DMEM高唐培養基+10%FBS，細胞刮棒沿著一個方向輕輕刮取細胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過濾的HEPES每次實驗時調節pH。細胞的培養本身就是一個復雜的過程，只有細胞處于最佳狀態時才能給科研工作者帶來更可靠的實驗結果，因此對于細胞的培養，我們更要花耐心和精力去呵護。

參考文獻：

[1]肖新華，廖二元，董源媛，等.小鼠單核細胞RAW264. 7的細胞生物學特征[J].南華大學學報，2008，36(3):283-285.

[2]汪民.立克次體免疫學研究的新進展[J].中國免疫學雜志，1986，2(6):376-379.

[3]Bak MJ， Truong VL， Kang HS， Jun M， Jeong WS. Anti-inflammatory effect of procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7 cells. Oxidative medicine and cellular longevity. 2013;2013: 409321.

[4]Yu-Mi Shin， Hyun-Joo Jung， Woo-Yong Choi，et al.Chang-Jin LimAntioxidative， anti-inflammatory， and matrix metalloproteinase inhibitory activities of 20(S)-ginsenoside Rg3 in cultured mammalian cell lines[J]. Mol Biol Rep (2013) 40:269-279.

[5]方瑤，毛旭虎，等.小鼠巨噬細胞 RAW264.7 的培養技巧及經驗總結[J].現代生物醫學進展，2012，12(22):4358-4359.

編輯/張燕