絲素蛋白/鈣磷復合基因支架的制備及表征

摘要：目的 人工合成的骨替代材料在治療部分類型的骨缺損時往往存在療效的不確定性，特別是在大范圍的骨缺損的修復中存在較高的失敗率，因此需迫切尋找新的解決途徑。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有良好的生物學性能，本研究擬改善絲素蛋白的骨誘導性能。方法 采用共沉積法制備了絲素蛋白/鈣磷復合材料，制備腺病毒Ad-BMP-2，然后制備絲素蛋白/鈣磷復合基因支架。將骨間充質細胞培養于其上，并采用掃描電鏡（SEM）觀察細胞的貼附，及檢測細胞增殖、分化的性能進行觀察。結果 SEM觀察顯示生物材料具有良好的孔徑；制備了Ad-BMP2腺病毒，病毒表達GFP綠色熒光蛋白；細胞學檢測發現該生物支架生物相容性好，細胞呈梭形，舒展充分，細胞核處隆起，細胞周圍可見基質附著。結論 該生物材料具有良好的孔徑及生物相容性，具有良好的應用前景。

關鍵詞：絲素蛋白；鈣磷復合材料；BMP-2；腺病毒

生物醫學組織工程是近年來繼基因工程之后取得重大技術突破的生命科學領域新的研究熱點。組織工程的三大要素是：具有增殖分化潛能的種子細胞、生物支架材料、生長因子。組織工程核心技術在于構建細胞與生物材料復合物。細胞外基質是構建組織工程化牙周組織的物質基礎，細胞在三維支架材料中不斷生長、增殖，并分泌細胞外基質取代逐漸降解的生物材料，最終形成具有活力的組織。本研究將絲素蛋白與磷酸鈣粉末混合，可使無機粉末均勻分布于絲素蛋白中，避免了無機粉末由于靜電作用互相聚集的傾向，利用仿生共沉積的方法獲得絲素蛋白磷酸鈣復合物，并結合BMP-2腺病毒，制備出絲素蛋白/鈣磷復合基因支架。

1 資料與方法

1.1絲素蛋白的制備 絲素蛋白的制備：①家蠶生絲脫膠 家蠶生絲置于約0.5‰的無水碳酸鈉溶液中，于90℃～100℃處理30min，重復3次，以脫去蠶絲中的絲膠。脫膠后洗凈，烘箱60℃烘干后得到精煉蠶絲；②絲素纖維溶解：配置CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩爾比1：2：8）三元溶液。于（70±2）℃在三元溶液中攪拌溶解拉松的家蠶精煉絲纖維，浴比1：10，時間1h，得到混合溶液；③透析將絲素溶液裝入透析袋，在流動自來水中透析48h之后換用去離子水，換1次/h水，持續48h。經透析得到純家蠶絲素蛋白溶液，溶液經紗布過濾裝入試劑瓶中保存于冰箱備用；④家蠶絲素蛋白溶液的濃縮：將純家蠶絲素蛋白溶液倒入玻璃表面皿，于45℃攪拌，用電扇吹加速其水分的蒸發，濃縮過程持續24h。蒸發濃縮過程中防止表面結膜和表面起泡沫。

1.2磷酸鈣/絲素蛋白復合物的制備 將0.588g CaCl2·2H2O溶解于40ml乙醇中，得到入氯化鈣乙醇溶液；將0.374 g of NaH2PO4·2H2O、2g絲素蛋白溶液溶解于24L去離子水中；逐步滴加氯化鈣乙醇溶解液，并在滴加過程中攪拌，之后靜置18～48h，得到沉淀的混合物。

將所得的沉淀物去離子水過濾漂洗3次，乙醇漂洗后一次后40℃真空干燥，得到磷酸鈣絲素混合粉末。將混合物加入5%的絲素蛋白溶液中并攪拌，獲得終濃度為5%的溶液。所得溶液4℃保持0～90min，-20℃～-80℃之間過夜后真空冷凍干燥，所得的復合多孔支架材料經過30%～100%的乙醇容易處理。

1.3質粒提取及病毒的合成 真核表達質粒PcDNA3.0-BMP-2由本人構建并保存[1]，首先制備腺病毒穿梭質粒的構建pAdTrackCMV-BMP-2， 并制備包含pAdEasy I 質粒的BJ5I83電穿孔感受態菌，得到pAd-BMP-2。

制備重組腺病毒Ad-BMP-2：取10μg pAd-BMP-2病毒質粒及陽性對照質粒pAdEasyI用Pac I 37℃酶切，線性化并回收。將上述pAd-BMP-2質粒用PacI酶切回收后取5μg線性化質粒，稀釋入無血清培養液中，同時將10μl lipofectamine2000稀釋入無血清培養液中，室溫放置5min。將稀釋的腺病毒DNA和lipofectamine2000混合后室溫放置20min。吸出原先含血清的培養液，加入含DNA-lipofectamine復合體的無血清培養液，24h后更換含10%小牛血清的新鮮培液，1d后開始定時觀察細胞毒效應。24～48h后通過熒光顯微鏡觀察EGFP的表達以確定轉染及病毒包裝成功。7～10d后可觀察細胞病理變化出現，同時表達EGFP的細胞數逐漸增多，此時收集293細胞于液氮和37℃水浴中反復凍融4次，離心取上清的1/2重新感染HEK293細胞進行擴增，5d后收集細胞，1500 r.p.m離心7 min小心棄上清以2ml PBS重懸，反復凍融4次，重復感染、收集步驟，如此反復進行5次后制備高滴度腺病毒。收集第5代病毒進行滴度（pfu/L）測定。

1.4絲素蛋白/鈣磷復合基因支架的制備及細胞培養實驗 將絲素蛋白/鈣磷復合材料置于在無菌操作臺內，將病毒液滴于支架上，使之浸潤，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的絲素蛋白/鈣磷復合材料支架上，4℃ 過夜使支架與質粒或腺病毒充分結合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥。

將骨間充質細胞（BMSCs）接種于絲素蛋白/鈣磷復合基因支架上，進行常規細胞培養，并在第5d進行電鏡觀察。

2 結果

2.1本方法制得的磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界；復合支架材料外部、內部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無明顯的磷酸鈣聚集。圖1顯示本方法所獲的磷酸鈣絲素蛋白復合多孔支架，磷酸鈣在絲素蛋白中分布均勻，支架孔隙連通率高。

圖1 復合支架的掃描電鏡圖片，磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界；復合支架材料外部、內部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無明顯的磷酸鈣聚集。

2.2 pAd-PDGFB質粒經Pac I酶切線性化后在lipofectamine2000介導下轉染HEK293細胞，1d后熒光顯微鏡下見約10%的細胞表達EGFP（圖2，圖3），以后逐天增加，3d后可見大量細胞均表達EGFP（圖4，圖5），當第7d細胞開始大量脫落并呈串狀時收集細胞。正常對照細胞則無此變化。將病毒滴度調整為2×1010 particles/ml.（表達形成單位/ml）。

2.3將細胞接種于復合基因支架，生物相容性好，所獲的復合支架材料由于表達BMP-2因此理論上具有骨誘導性，同時機械強度未下降。圖6顯示生物材料具有適合細胞生長的孔徑，細胞伸展附著較好。

3 討論

外源性生長因子的引入可促進骨再生，然而外源性生長因子半衰期較短，要求相對大的劑量才能刺激足量的組織形成而發揮治療作用，增加了臨床應用成本并可能導致毒性作用的產生，同時應用外源性生長因子還存在需反復給藥、易流失和效率低等缺點。隨著基因技術的發展，通過轉移技術來實現生長因子內源化的方法已逐漸成熟。將有治療作用的基因通過一定方式導入靶細胞，以維持較高的生長因子濃度，促進組織愈合及再生。這樣就避免了應用外源性生長因子蛋白所帶來的弊病，在骨再生及組織工程中有廣闊的應用前景。基因傳遞系統的載體分為病毒載體系統和非病毒載體系統[2]。非病毒載體主要為質粒DNA、脂質體-DNA復合物、分子耦聯載體等，其具有毒性及免疫反應低，穩定，抗原性小，質粒DNA易于獲取容易，但其基因轉移率低，而且不能長期表達，組織的特異性不高，需要大量、持續、反復使用，且基因表達時間短。常見的病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、慢病毒、人細胞巨化病毒等。逆轉錄病毒、慢病毒在及腺病毒相關病毒rAAV體內呈損失性感染，其免疫反應低。Sugiyama等學者用用慢病毒介導BMP-2先體外后體內基因觀察肌肉內成骨，發現BMP-2促進骨再生，植入8w后BMP-2仍然持續表達，顯示了慢病毒在骨再生治療中的前景[3]。腺病毒是最常用于骨缺損修復的基因載體[4]，它可插入7.5kb的外源基因，且相對穩定，能純化和濃縮，它存在以下優點：可感染分裂及非分裂期的細胞；腺病毒載體無需整合進宿主細胞基因組中，目的基因在宿主細胞基因組外游離狀態下表達，整合突變致癌可能性小，基因毒性低。重組腺病毒構建較早使用的是雙質粒轉染法，將目的基因亞克隆至穿梭質粒中構建成轉移質粒，再與腺病毒基因組質粒共轉染293細胞，兩質粒借所帶的部分同源序列在293細胞內發生同源重組而形成重組體，并進一步包裝成重組腺病毒顆粒。因為該種制備方法要求兩種質粒的共轉染及同源重組必須同時發生在293細胞內，才有可能形成重組體并包裝成病毒，由于細胞內質粒共轉染效率較低，同源重組效率更低。目前較多使用的為AdEasy系統[5]，其腺病毒質粒同源重組在大腸桿菌中高效進行，且細菌繁殖快，同源重組能力強，因而從根本上克服細胞內同源重組率低的缺陷。同時由于在腺病毒骨架中含有的EGFP報告基因，便于監測病毒是否包裝成功，大大減少了病毒的制備時間。

有學者利用飽和磷酸鈣在仿生液中的析出特性，將生長因子與磷酸鈣沉積于種植體表面，形成一層三維的晶格，生長因子在第五周仍然緩慢釋放，促進了骨的愈合，顯示了生長因子通過共沉積達到緩釋的潛質[6]。然而，該沉積方法獲得的支架的三維孔狀結構及表面孔隙不可避免的部分喪失[6，7]。也有學者通過熔鹽浸取法獲得的CaP復合支架，然而存在機械強度不足的缺點[8]。電沉積法可通過改變電壓電流獲得良好的表面形貌和化學成分[9]，然而在最佳點沉積條件下的PH值和溫度均不會破壞生長因子的活性。絲素蛋白由于良好的機械性能及生物相容性及可降解性[10-11]作為組織工程材料已廣泛應用。本實驗將絲素蛋白與磷酸鈣粉末混合，可使無機粉末均勻分布于絲素蛋白中，避免無機粉末由于靜電作用互相聚集的傾向。利用仿生共沉積的方法獲得絲素蛋白磷酸鈣復合物，再與組織工程支架結合，有望獲得均勻孔徑的三維支架，隨著絲素蛋白與多孔生物陶瓷支架結合，可改進其機械性能，同時生長因子隨著磷酸鈣的溶解而釋放而達到緩釋的目的。

本方法所獲的磷酸鈣絲素蛋白復合多孔支架細胞生物相容性好，制作過程無需添加有毒的化學偶聯劑，工藝流程簡單； 磷酸鈣與絲素蛋白具有改善的交界； 磷酸鈣在絲素蛋白中分布均勻，支架孔隙連通率高。復合支架材料外部、內部孔徑孔隙率一致，孔分布均勻； 制備的支架底部無明顯的磷酸鈣聚集。所獲的復合支架材料具有骨誘導性，同時機械強度未下降。生物材料具有適合細胞生長的孔徑，同時緩釋BMP-2基因，可應用于組織工程支架領域，以替代自體骨移植等，具有廣泛的應用前景。

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編輯/哈濤