免疫組化和PCR方法檢測乳癌腋窩淋巴結微轉移的比較

摘要：目的 探討通過不同方法檢測腋窩淋巴結MUC1基因表達，以提高微轉灶診斷率。方法 收集2010～2012年我院收住的手術患者26例，108個常規組織學檢查陰性的腋窩淋巴結，分別用免疫組化及RT-PCR法測定MUC 1 mRNA的表達。結果 MUC 1 mRNA陽性檢出率為66%，明顯高于蛋白表達檢出率21%（P<0.05）。結論 建立起MUC 1 基因的RT-PCR分析法，進一步提高微轉移灶診斷率，較免疫組化更為敏感。

關鍵詞：MUC 1 粘蛋白；乳腺腫瘤；免疫組化；RT-PCR

淋巴結微轉移是指常規病理難以發現的<2 mm的癌轉移灶[1]，其存在與否會直接影響患者的預后。隨著技術的進步，微轉移檢測先后出現連續切片法[2]、免疫組化法[3]和PCR法[4]等。本文用不同方法進行了微轉移灶診段的研究。以評估并建立乳腺淋巴結微轉移灶診斷的較佳方法。

1資料與方法

1.1一般資料 20例乳腺癌組織（以浸潤性導管癌為主）及對應108個腋窩淋巴結手術切除標本、26例乳腺良性腫瘤標本取我院2010～2012年收住的手術患者，所取標本在術后1.5 h內置液氮中保存，并切留部分相應常規病理學檢查及免疫組化分析。另取手術膽結石患者的肝十二腸韌帶淋巴結作為正常無轉移淋巴結對照。

1.2.1免疫組化研究 免疫組化染色用SP法。操作方法按SP試劑盒說明書進行，每批設已知乳腺癌陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。陽性判斷：胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，胞漿無棕黃色顆粒為陰性細胞。判定標準：（-）：陽性細胞占10%以下；（+）：陽性細胞比例為10%～30%（++）：陽性細胞比例為30%-50%（+++）：陽性細胞比例>50%者。根據細胞漿粽染再結合細胞形態確定微轉移。

組織粽RNA提供采取異硫氰酸胍。AMV逆轉錄酶42℃作用60 min合成cDNA，再以此為模板結進行PCR循環。循環參數為94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環。陰性對照用未做逆轉錄的總RNA做模板，空白對照在擴增時不加Taq DNA聚合酶。RT-PCR結束后，取擴增產物10，進行2%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，Kodak Digital Science凝膠成像系統照，得出結果。

1.3統計學分析 兩種結果統計處理用χ2檢驗。

2結果

2.1 MUC 1基因免疫組化結果 MUC 1蛋白在癌變細胞中表達于胞膜和胞漿，微轉移表現為單個散在或2～3個及數個聚集成小團狀的癌細胞位于淋巴結內。個別淋巴結內巨噬細胞，漿細胞等可見MUC 1交叉反應，結合細胞形態特點部位及染色特征可以區分，見表1。

2.2乳癌患者MUC 1 mRNA 表達情況 臨床樣本MUC 1 和內參照B2-微球蛋白基因擴增分別得到288 bp和150 bp左右的條帶，與所設計的片段大小相符。空白對照組和陰性對照均未見擴增條帶。

20例乳腺患者的108個HE染色未見轉移的淋巴結中71個經RT-PCR擴增后有MUC 1 mRNA表達，陽性檢出率為66%。8例乳腺組織，7個HE陽性淋巴結及6例正常乳腺組織MUC 1 mRNA陽性表達率分別為100%、100%及100%，見表2。

2.3不同方法檢測MUC 1 基因表達結果比較 在109個常規病理學檢查陰性的淋巴結中，免疫組化發現23個有MUC 1 蛋白的表達，再進一步行RT-RCR檢測發現71個表達MUC 1 mRNA，表明腫瘤隱蔽淋巴結轉移的存在，這種轉移可能是一個或數個腫瘤細胞轉移引起的。RT-PCR法使微轉移灶的診斷由免疫組化的21%增加到66%，經統計學分析兩種方法陽性檢出率有顯著差異（P<0.005），提示RT-RCR法更為敏感，大大提高了微轉移灶的診斷率。

3討論

乳癌發病率逐年上升，目前以外科手術為最主要的治療手段。影響乳癌患者術后預后的因素很多，其中腋窩淋巴結有無轉移、淋巴結轉移量、水平和部位對臨床選擇治療方案及預后評估至關重要。研究表明：惡性腫瘤細胞的轉移是主要致死因素，而淋巴道轉移是主要轉移途徑之一，淋巴結轉移與生存率呈負相關[5]。有統計表明淋巴結陰性的乳癌患者術后5年內仍有20%左右死于遠處轉移，可以認為這些患者在診斷之初可能就存在隱蔽的淋巴結轉移或全身轉移[6-7]，用常規的組織病理方法甚至免疫組化方法都不易發現，需要尋找更為敏感有效的標志物或方法來解決這一問題。

檢測轉移腫瘤細胞，需利用能區別于轉移部位組織而腫瘤細胞特異性表達的生物學標志物。因乳癌絕大數都發源于上皮組織，故上皮組織的某些特異性標志物可作為轉移腫瘤細胞的標志物用于淋巴結中微轉移灶的檢測。MUC1黏蛋白是一種高分子量膜糖蛋白，其分布具有明顯的組織特異性，主要在于某些上皮組織和器官中，如乳腺，胰腺，卵巢和結腸等，特別是在所有正常及乳癌組織中均表達而在間葉組織來源的淋巴結中不表達。

靈敏特異的RT-PCR法的應用，隨著循環次數的不同，Taq酶用量的不同可能會提高方法的敏感性，但也由此導致假陽性結果的可能，需不斷改進。我們用PCR法對微轉移研究的最終目的是選擇病理學上腋淋巴結陰性乳癌患者中的高危復發人群，以指導臨床預后，而并非是該方法的最大敏感性及對臨床分期的具體知道。目前對于高靈敏度方法檢出的微轉移灶其生理意義仍有爭議。有研究表明，存在淋巴結微轉移的乳癌患者預后不良。微轉移癌細胞進入淋巴結后可能有3種轉歸：①繼續增生形成大轉移灶最終全身轉移；②被機體免疫系統清除；③暫時進入靜止期，待環境適宜時，再增生形成大的轉移瘤。故RT-PCR法檢出微轉移的患者并非一定復發，但可能提示有形成轉移傾向。相信隨著觀察例數的增多，隨訪時間延長，微笑轉移灶的臨床意義會更加明顯。

編輯/肖慧