大黃素對胃癌細胞BGC—823增殖和凋亡影響的研究

摘要：目的 研究大黃素對胃腺癌細胞BGC-823增殖及凋亡的影響。方法 采用細胞培養技術、四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法、流式細胞技術等試驗方法，觀察大黃素對BGC-823細胞生長和凋亡的影響。結論 BGC-823細胞在大蒜素作用后生長抑制、凋亡等形態學表現，大黃素對胃癌細胞有明顯的抑制作用，且抑制作用與大黃素的濃度和作用時間呈正相關。結論 大黃素可顯著抑制體外培養的胃癌細胞的生長，并具有誘導凋亡的作用，其抑制作用具有時效和量效關系。

關鍵詞：大黃素；胃癌；凋亡；細胞周期

在我國，胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的第3位，占消化道腫瘤的首位。大黃素（Emodin，EM）是從大黃中提取的一種天然蒽醌類衍生物，是大黃、虎杖、何首烏、虎杖等多種中藥的有效活性成分。其具有多種生物學功能，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、降血脂、保肝利膽等。本研究探討大黃素對人胃癌細胞BGC-823細胞體外增殖和凋亡的影響，初步探討大黃素用于胃癌治療的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細胞系 人胃癌細胞BGC-823購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清購自杭州四季青公司，RPMI 1640購自Gibco公司；大黃素（西安天豐生物科技有限公司），噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、谷氨酰胺均為美國Sigma公司產品；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自Molecular BiologyChemical公司。酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司），流式細胞儀（Beckman Coulter，美國貝克曼公司），離心機（Eppendorf公司），倒置顯微鏡（Olympus公司），CO2培養箱（日本三洋公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人胃癌細胞株BGC-823培養于含10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，培養條件為37℃、5%CO2/95%空氣，相對濕度為98%的環境，單層生長，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測大黃素對胃癌細胞株BGC-823增殖的影響 取對數生長期的胃癌細胞懸液接種于96孔培養板，每孔100μl（含2×104個細胞），置37℃，98%濕度，5%CO2條件培養至細胞貼壁后，換新鮮培養基并加入不同濃度的大黃素（每一濃度設6個復孔）處理24、48、72h后，每孔加入90μl新鮮培養基和5%MTT 10μl，繼續培養4h后棄上清，每孔再加入100μl DMSO，振蕩10min，用酶聯免疫檢測儀測定吸光值。細胞存活率=（實驗組OD值-本底OD值）/（對照組OD值-本底OD值）×100%，實驗重復3次。

1.2.3細胞凋亡檢測 取對數生長期的胃癌細胞BGC-823接種于細胞培養皿，培養至細胞貼壁后，用不同濃度的大黃素處理48h后，消化細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度至1×109/L。取1mL細胞，1000 r/min 4℃離心10min，棄上清液。加入1mL冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 r/min 4℃離心10 min，棄上清液。將細胞重懸浮于400μl結合緩沖液，加入5μl Annexin V-F ITC，混勻后室溫避光孵育15min后，加入10μl P I于室溫避光放置5min后立即上機檢測。Annexin V-FITC/PI法分別以525nm、620nm紅色熒光和綠色熒光檢測細胞，PI作為一種可嵌入DNA雙鏈的紅色熒光物質，不能通過完整的細胞膜，對活細胞和凋亡的細胞均不能染色，但可進入壞死細胞，因此可使壞死細胞發出紅色熒光，通過熒光素標記的膜聯蛋白（用于檢測凋亡細胞外膜上的磷酯酰絲氨酸）和對細胞進行雙染色，可將凋亡細胞、活細胞和壞死細胞區分開來。經流式細胞儀測量軟件可直接測得每個樣本10000個細胞中正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細胞所占的比例。

1.2.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理，統計分析方法根據實驗設計的方案而定，實驗數據用均數±標準差（x±s）表示，采用χ2檢驗和t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1形態學結果 倒置顯微鏡觀察BGC-823胃癌細胞經不同濃度大黃素處理后形態的變化并拍照。鏡下觀察發現，未經藥物處理的BGC-823胃癌細胞貼壁伸展，形態舒展，折光均勻，細胞核大而明顯（圖1A）。低濃度的水提物處理48 h后細胞收縮變小，與周圍細胞分離，細胞核周圍出現較多空泡樣結構，細胞核物質邊集（圖1B），而高濃度的大黃素作用48h后，部分細胞出現細胞核異常凝集，核固縮和凋亡小體形成等典型的細胞凋亡形態（圖1C）。

A：對照組；B：20μmol/L大黃素作用后的胃癌細胞形態學變化；C：80μmol/L大黃素作用后的胃癌細胞形態學變化

圖1 大黃素作用48h對BGC-823胃癌細胞形態學變化圖

2.2大黃素對胃癌細胞抑制增殖的作用 不同濃度大黃素處理細胞24、48、72h后MTT法檢測分析發現大黃素對該細胞的生長有明顯抑制作用，并呈時間和劑量依賴關系，并求得藥物半數抑制濃度。見表1，圖2。

圖2 不同時間不同劑量大黃素對胃癌細胞BGC-823生長抑制曲線

2.3大黃素對胃癌細胞凋亡率的影響 給予大黃素干預48h后，腫瘤細胞凋亡比例隨著藥物濃度的升高逐漸升高，活細胞比例逐漸降低（見圖3）。在一定的濃度范圍內，隨著大黃素的濃度增加，腫瘤細胞的凋亡率也增加。

對照組 10μmol/L組 20μmol/L組

40μmol/L組 60μmol/L組 80μmol/L組

圖3 不同濃度大黃素作用于BGC-823胃癌細胞

48h后的流式細胞分析結果

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展不僅與腫瘤細胞分化異常、細胞增殖過度有關，而且與細胞凋亡減少有關。關注并重視胃癌治療及其研究意義重大。

現代分子生物學研究認為，細胞增殖與凋亡的失衡是腫瘤發生的重要機制。但使用中藥大黃素臨床治療腫瘤多為經驗用藥，其抗腫瘤機制報道較少。

本實驗通過分析不同濃度的大黃素作用于體外培養的人胃癌細胞BGC-823細胞系，發現其可以抑制腫瘤細胞的生長，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，抑制率呈明顯上升的趨勢。Annexin V-FITC/PI檢測胃癌細胞的凋亡，發現不同濃度的大黃素作用于腫瘤細胞后，腫瘤細胞凋亡率明顯升高。說明大黃素可抑制胃癌細胞株BGC-823的生長作用，這種作用可能是通過促進胃癌細胞的凋亡而實現的。這為大黃素進一步用于防治胃癌提供了有用的實驗數據[1-4]。

參考文獻：

[1]王春光，劉北忠，金丹婷，等.大黃素對裸鼠體內K562細胞移植瘤的抑制作用及其與調控Caspase3和Caspase9表達的關系[J].中草藥，2010，41（5）：751-756.

[2]李月珍，劉志新，蔡克瑞，等.高濃度蘆薈大黃素誘導胃癌細胞凋亡的作用[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（12）：908-911.

[3]左文英，陳媛媛，蔡駿，等.大黃素抑制人結腸癌RKO、Caco-2細胞體外增殖作用的研究[J].遼寧中醫雜志，2013，40（3）：580-582.

[4]孫桂斌，張萌，嚴方，等.大黃素抗腫瘤活性及相關機制研究進展[J].藥學進展，2013，37（6）：248-256.

編輯/哈濤