p—STAT3 與HER2在乳腺癌分子亞型中表達的相關性分析

摘要：目的 探討p-STAT3（磷酸化的信號轉導和轉錄激活因子3）及人類表皮生長因子受體-2（HER2）在乳腺癌分子亞型中的表達及其相關性。方法 根據Nielsen標準進行分子分型的59例乳腺癌組織切片，應用免疫組化技術檢測p-STAT3及HER2的表達水平。結果 在乳腺癌各分子亞型中，p-STAT3均有表達，且可觀察到p-STAT3在細胞核內的定位。在腺腔A型、腺腔B型、HER2過表達型、基底樣型乳腺癌中，p-STAT3的表達率分別為21.42%、83.33%、83.33%、66.67%， p-STAT3與HER2在乳腺癌分子亞型中的表達水平呈正相關關系（r=0.452，P<0.01）。結論 p-STAT3與HER2在乳腺癌分子亞型中的表達水平呈正相關關系。

關鍵詞：乳腺癌；分子分型；免疫組織化學；p-STAT3；HER2

乳腺癌是近年來發病率持續增高的女性惡性腫瘤，其高度異質性導致臨床預后的多態性。近年來，不少學者根據分子基因的表達，將乳腺癌分類成不同的亞型[1]：Luminal亞型（ER/PR+）、HER2過表達型（ER-、PR-、HER2+）、Basal-like（ER-、PR-、HER2-）型和Normal-like型，并發現不同分子亞型乳腺癌的預后有顯著差異[2]。HER2是原癌基因CerB2編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，屬表皮生長因子受體家族，與腫瘤形成密切相關[3]，過表達HER2乳腺癌的侵襲性增強[4]。STAT3作為HER2的下游分子，是信號轉導和轉錄激活因子家族（signal transducer and activator of transcription，STATs）中重要成員，已被確定為癌基因[5]，因其本身及其磷酸化形式（p-STAT3）在多種腫瘤組織和細胞系中持續激活和異常表達，轉移及血管生成有關[6]，且p-STAT3可促進抗凋亡基因的表達，有拮抗某些化療藥物的作用，其與乳腺癌的相關性研究成為近年來惡性腫瘤信號通路研究的熱點[7]。在乳腺癌的分子亞型中，HER2的過表達是否伴隨著p-STAT3的高表達即二者的相關性研究尚無文獻報道，因此本實驗擬通過檢測p-STAT3在乳腺癌組織各分子亞型中的表達情況，并分析其與組織中HER2表達的相關性，探討STAT3是否可作為乳腺癌分子分型的補充，為乳腺癌患者的分子靶向治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月～2013年9月徐州醫學院附屬醫院病理科有完整切片和石蠟檔案及病歷資料的浸潤性乳腺癌病例59例及乳腺纖維腺瘤病例10例，其中乳腺癌腺腔A型14例，腺腔B型15例，基底樣型13例，HER2過表達型17例。試劑：兔抗人p-STAT3抗體及兔抗人HER2抗體購自美國EPITOMICS公司。MaxVision快速法試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液等試劑購自邁新公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學法檢測p-STAT3表達 p-STAT3抗體1：200濃度稀釋，室溫靜置備用。主要實驗步驟：①脫水：65°C 烤箱中干烤30 min；②脫蠟：二甲苯I中浸泡15 min，之后二甲苯II中浸泡15 min；⑴在無水乙醇I、無水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中分別浸泡各5 min；⑵雙蒸水中浸泡5 min；③微波修復抗原：將切片浸入枸櫞酸修復液，先高火2 min將沸未沸時轉至低火，持續約5 min；⑴室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑵3%雙氧水室溫孵育5-10 min；⑶室溫下PBS洗滌5 min×3次；④封閉：滴加正常羊血清封閉液（A試劑），37°C 孵育10-15 min；⑴滴加p-STAT3一抗，37°C 2-3h，后室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑵滴加二抗（B試劑），37°C ，30 min，室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑶滴加C試劑，37°C ，30 min，室溫下PBS洗滌5 min×3次；⑤DAB顯色：滴加新鮮配置單DAB顯色液，室溫下放置3-10 min，至顯棕色為止，蒸餾水終止反應，并洗滌；⑥蘇木素復染，3-4 min后流水沖洗；⑦分化：1%鹽酸酒精中浸泡1-2 s后流水沖洗；⑧藍化：氨水中浸泡30s-1 min后流水沖洗；⑴脫水；⑵透明；⑶中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2免疫組織化學法檢測HER2表達 兔抗人HER2抗體按預實驗結果1：200稀釋，室溫靜置備用。步驟同\"免疫組織化學法檢測p-STAT3表達狀況\"。

1.3結果判斷

1.3.1組織p-STAT3表達水平的結果判定 免疫組化染色結果根據陽性細胞的數量和染色深度綜合判斷，以細胞漿和/或細胞核中出現清晰棕黃色顆粒為陽性細胞。參照文獻[8]按3分制計分：0，陰性或陽性細胞數<5%；①陽性強度弱或陽性細胞數<20%；②強陽性或陽性細胞數≥20%。其中0分視為陰性，1分和2分均視為陽性。以上標準均隨機選取5個高倍視野，計數500個細胞，計算出其中陽性細胞的百分率。

1.3.2組織HER2表達水平的結果判定 免疫組化染色結果根據陽性細胞的數量和染色深度綜合判斷，以細胞膜上出現清晰棕黃色顆粒為陽性細胞。參照文獻[8]判斷標準為：-：無著色； +：任何比例的浸潤癌細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色；++：>10%的浸潤癌細胞呈現弱至中等強度、完整但不均勻的細胞膜棕黃著色或<30%的浸潤癌細胞呈現強且完整的細胞膜棕褐著色；+++：>30%的浸潤癌細胞呈現強的、完整的細胞膜棕褐著色。IHC法HER2-/+者判定為HER2陰性；HER2++、+++者判定為HER2陽性。以上結果均由兩位高年資的病理科醫生評估。

1.4統計學分析 實驗結果用SPSS13.0軟件進行統計分析，采用Spearman相關分析對所得數據進行統計學處理。P<0.05認為有統計學意義。

2 結果

根據乳腺癌ER、PR、HER2的不同表達情況將乳腺癌分為 Luminal A型，Luminal B型，HER-2（+）型，basal-like型，采用上述四種分子分型的乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織，通過免疫組織化學技術觀察p-STAT3、HER2的蛋白表達情況。IHC結果示p-STAT3蛋白主要分布在細胞核內（圖H），HER2蛋白主要定位于細胞膜上（圖E），在乳腺纖維腺瘤中HER2及p-STAT3蛋白的表達均呈陰性（圖A、B）；在乳腺癌各分子亞型中的表達情況分別如下圖中所示。

3 討論

近年來乳腺癌信號轉導途徑在腫瘤細胞中抗凋亡和促進分化增殖的作用越來越受到重視，其中，信號傳導轉錄活化蛋白家族途徑的研究尤為突出。有超過40種的細胞外多肽物質可以與細胞表面的特異性受體結合，從而引發胞漿內STATs的活化。迄今為止，在哺乳動物中發現的STAT家族包括7個成員，它們廣泛表達于不同類型的細胞和組織中，參與細胞的生長、惡性轉化及凋亡等功能的調控。STAT3作為STATs的重要成員，可以通過直接或間接調控相關基因的表達，在細胞增殖、凋亡、分化和血管生存等方面發揮著重要作用，并在多種腫瘤中異常表達，例如：白血病、非小細胞肺癌、前列腺癌、肝癌等[9，10]。在某些細胞外因子作用下，STAT3磷酸化激活，通過SH2結構域形成二聚體，進入細胞核后發揮轉錄調控作用，實驗中我們觀察到p-STAT3主要定位于乳腺癌細胞的細胞核內（圖H），與文獻報道相一致；生理狀態下，細胞中STAT3的激活短暫，但在惡性腫瘤細胞中STAT3被持續激活，這也與我們上述實驗結果相符合（圖H）。有研究顯示，乳腺癌p-STAT3的表達較乳腺良性病變顯著增高，這與我們實驗中所觀察到的結果相符，并且其表達與乳腺癌的瘤體大小、淋巴結轉移密切相關，提示p-STAT3在乳腺癌的生長、侵襲等惡性演進過程中發揮重要作用[11]。Horiguchi等[12]通過免疫組化分析認為p-STAT3的高表達與腎癌的發生發展、預后等密切相關。

本實驗通過檢測術后乳腺癌組織各亞型中HER2及p-STAT3的表達情況，分析二者的相關性，得出二者在各亞型中呈正相關關系，表明HER2在亞型中的表達情況與p-STAT3的表達情況近似一致，初步認為p-STAT3可補充現有的乳腺癌分子分型，且HER2很可能通過激活p-STAT3引起乳腺癌的惡性生物學行為。

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編輯/哈濤