不同用藥時間 AMD3100對人肝癌HepG2細(xì)胞AFP表達(dá)的影響

摘要： 目的： 檢測不同時間點AMD3100對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及其與甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）表達(dá)的影響并探討其意義。方法： MTT 法檢測不同時間AMD3100對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響； Western blott分析不同時間點AMD3100對AFP表達(dá)的影響；結(jié)果： AMD3100對人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率在36h、48h、72h分別為35.2%、44.3%和56.3%，P<0.05；HepG2細(xì)胞AFP的表達(dá)減少，在36h、48h有顯著性差異。這兩方面的作用有時間依賴性；結(jié)論： AMD3100對HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用呈時間依賴性，這種抑制作用與抑制CXCR4信號軸有關(guān)，還可能與AFP的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞： AMD3100；甲胎蛋白；肝癌細(xì)胞；癌細(xì)胞增殖；CXCR4

【中圖分類號】R749.053【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1672-8602（2014）07-0152-02

基金項目： 國家自然科學(xué)基金項目（30960153）；2013年海南省教育廳重點項目（Hjkj2013-27）

AMD3100是趨化因子受體CXCR4（ CXC chemokine receptor 4，CXCR4）特異性阻斷劑，是一種小分子非肽類抑制劑，是橋聯(lián) 1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷，它在治療腫瘤、HIV 感染、炎性疾病和干細(xì)胞動員中具有很強的應(yīng)用潛力[1]。AFP是早期診斷肝細(xì)胞癌的特異性標(biāo)志物，具有促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的增殖作用[2，3]。本研究應(yīng)用AMD3100作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，觀察其在不同時間點對HepG2細(xì)胞生長的影響及其與AFP表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供），兔抗人AFP抗體， CXCR4抗體，β-actin 抗體，辣根標(biāo)記的羊抗兔IgG均購買于Stanta Cruz（America）公司；AMD3100（Sigma，America），DMEM高糖培養(yǎng)基，MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide），96、6孔板均購自美國Gibco公司。優(yōu)質(zhì)胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；蛋白質(zhì)印記marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；硝酸纖維素膜（BioRad，America）。

1.2方法

1.2.1 MTT法檢測不同時間AMD3100對細(xì)胞增殖的影響

用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別以合適的密度接種于96孔板（12h組1.0×105個/ml；24h組及36h組5.0×104個/ml；48h組3.0×104個/ml；72h組2.0×104個/ml），100μl/孔，每組設(shè)6個平行孔。培養(yǎng)24h后，更換新的培養(yǎng)液，100μl/孔。對照組不處理，加藥組加入AMD3100至終濃度為1.5μg/ml，對照組加入與加藥組同體積的H2O（因AMD3100溶于水）。分別在細(xì)胞培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，72h后，每孔加入20μlMTT，37℃孵育4h。去掉所有的液體，加入100μl/孔二甲基亞砜，微量振蕩儀振蕩10min，自動酶標(biāo)儀（Bio-TEK Instruments.Inc）在490nm波長測吸光值。細(xì)胞增殖抑制率=（對照組OD-實驗組OD）/ 對照組OD。

1.2.2 Western blot檢測不同時間點AMD3100對AFP表達(dá)的影響。

將HepG2細(xì)胞按合適的密度（12h組1.0×105個/ml；24h組及36h組5.0×104個/ml；48h組3.0×104個/ml），接種于6孔板中，每組設(shè)3個重復(fù)平行孔，加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，24h后，對照組不處理，加藥組分別加入AMD3100至終濃度為1.5μg /ml培養(yǎng)細(xì)胞。分別在細(xì)胞培養(yǎng)0h，12h，24h，36h，48h后，收取細(xì)胞，提取蛋白，定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳，再把蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜，進(jìn)行抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光儀（LAS3000）（FUJI，Japan）檢測細(xì)胞AFP表達(dá)的變化，具體操作按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test，P﹤0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，P﹤0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMD3100對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果表明，在12h，24h，AMD3100對HepG2細(xì)胞的增殖沒有顯著性影響，在36h，48h和72h，AMD3100對HepG2細(xì)胞增殖抑制率分別為 35.2%，44.3%和56.3%，和對組比較有顯著性差異，呈時間依賴性，P<0.01（見圖1）。

圖1.不同的時間點AMD3100對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

AMD3100（1.5 g/ml）處理HepG2細(xì)胞，分別在12h，24h，36h，48h，72h，用MTT法檢測并計算其抑制率。和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 不同用藥時間點AMD3100對HepG2細(xì)胞AFP表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，用濃度為1.5 g/ml的AMD3100處理HepG2細(xì)胞，在12h，24h，HepG2細(xì)胞表達(dá)AFP沒有顯著性變化，在36h、48h，HepG2細(xì)胞表達(dá)AFP顯著減少，呈時間依賴性。