鼠樹突狀細胞體外培養及鑒定

摘要：目的 探尋鼠骨髓來源樹突狀細胞體外培養的方法并進行鑒定。方法 體外誘導鼠骨髓細胞分化為樹突狀細胞，觀察形態學變化，分析細胞特異性標志物，同時進行誘導同種異體混合淋巴細胞發生增值能力的檢測。結果 培養216 h后樹突狀細胞高倍鏡下可見典型的樹突樣特點。成熟樹突樣細胞cd11c、mchII、cd86表達水平較高，可誘導同種異體混合淋巴細胞發生增值。結論 本方法為研究樹突狀細胞的功能以及運用提供材料。

關鍵詞：樹突狀細胞；培養；鑒定

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前所知的功能最強的抗原提呈細胞，是由加拿大學者Steinman于1973年發現的，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。本研究從小鼠骨髓中誘導培養出樹突狀細胞，并對其生物學特性進行分析鑒定，為優化DC的體外培養方法進行積極探索，從而為進一步研究其性能奠定了基礎[1]。

1資料與方法

1.1一般資料 雄性健康6～8 w齡balb/c小鼠、KM小鼠，購自第三軍醫大學實驗動物中心[2]。

1.2主要試劑 重組小鼠白細胞介素4（rmIL-4）和重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）（購自日本MBL公司）。脂多糖（LPS）（購自SANTA公司），熒光抗體PE-Cy5 anti-mouse CD11c、PE anti-mouse MHCII、PE anti-mouse CD86、CD80、（均購置美國Abcam公司）。RPMI1640培養液、胎牛血清（FBS）（購自美國RD公司）

1.3方法

1.3.1鼠骨髓來源樹突狀細胞的分離培養 將細胞因子rmGM-CSF（10 ng/mL）和rmIL-4（10 ng/mL）與FBS、 RPMI1640培養液充分混合，形成全營養培養液，于4℃環境保存。于開始收集細胞前30 min取出后復溫于室溫。溺死balb/c小鼠，75%醫用酒精消毒5～10 min，無菌生物柜中分離出脛骨和股骨，將肌肉除去，剪開骨兩端，用注射器針頭沖洗出骨髓至培養皿，用300目篩網過濾骨髓組織懸液，將過濾液倒入離心管中。事先準備小鼠淋巴細胞分離液，小心將骨髓組織懸液緩慢加入分離液表層（比例為2∶1）。高速離心4000轉15 min后，管內液面出現3個不同層次，將中層的白膜層液體收集，于緩沖液沖洗，離心2000轉，15 min，再反復沖洗離心兩次。用細胞計數器、全營養培養液將末次離心后懸液調細胞濃度1～3×106/mL，并接種于50 mL培養瓶，置5%CO2、37℃的培養箱中。于第72 h，加入含rmGM-CSF（10 ng/mL）和rmIL-4（10 ng/mL）的完全培養液3 mL；于第120 h，再次加入上述濃度細胞因子的完全培養液3 mL，第168 h時半量換液，離心，加入脂多糖（1 μg/mL），至第216 h，收集所有的懸浮于培養瓶液面細胞，并吹打瓶壁，收集，此即為本次試驗所用的鼠骨髓來源的樹突狀細胞（BMDC）。每個實驗日用倒置顯微鏡觀察細胞，記錄其生長過程和形態演變。

1.3.2骨髓來源樹突狀細胞表面標志物測定 將培養至第216 h的樹突狀細胞，以細胞計數板調整細胞濃度為3×105/mL，加入2 μL CD80、CD86、mhcII單抗和CD11c單抗。設立對照組。30 min反應后于流式細胞儀測定。

1.3.3同種異體淋巴細胞反應（MLR） 溺死KM小鼠，將其脾臟分離，碾磨，混合RPMI 1640培養液，過300目篩網后收集細胞懸液。以前文所述分離淋巴細胞方法分離出淋巴細胞，于5%CO2，37℃的環境中4 h，可得到試驗所用反應細胞。加入絲裂霉素（80 μg/mL）500μl處理樹突狀細胞作為刺激細胞，調整混合淋巴細胞濃度為3×106/mL，加入48孔培養皿，各200 μL/孔，按未成熟樹突狀細胞、成熟樹突狀細胞、空白對照分成三組，分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40四種刺激細胞濃度與反應細胞比例加入48孔板。設置復孔，終體積為400 μL。于5%CO2，37℃環境混合培養120 h。在混合培養結束前24 h，加入3H-TdR標記，并檢測CPM值。

1.4統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。所有數據用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗進行統計學分析。

2結果

2.1樹突狀細胞的生長 高倍鏡下觀察，8 h后可見細胞小而圓形，懸浮，分布均勻，30 h后可見一部分細胞貼瓶壁，一部分懸浮，見圖1，第48 h出現少許懸浮細胞，將其吸取后可看見點狀細胞集落；第72 h可見數量較多細胞團，見圖2，第120 h后，細胞多呈半懸浮狀態，體積較前明顯增大并聚集，細胞外圍可見明顯的樹突樣突起，可見分叉，見圖3；第168 h，細胞基本從瓶壁脫離、成簇懸浮，體積較前更大，樹突樣突起更加明顯，且較粗大，見圖4。

圖1 第30 h高倍鏡下影像（×200） 圖2 第72 h高倍鏡下影像（×400）

圖3 第120 h高倍鏡下影像（×400） 圖4 第168 h高倍鏡下影像（×400）

2.2樹突狀細胞表面標志物的檢測 收集經rmIL-4和rmGM-CSF誘導培養第120 h、第168 h和添加脂多糖后第216 h后的細胞，流式細胞儀測定第120 h：低表達CD11c（36.22%），低表達mchII（57.41%）和CD86（40.24%），為未成熟樹突狀細胞表面標志物特點；第168 h：高表達CD11c（60.11%），低表達mhcII（71.08%）和CD86（72.33%），為較成熟樹突狀細胞表面標志物特點；而經脂多糖刺激后的樹突狀細胞高表達CD11c（84.68%），且高表達mchII（95.97%）和CD86（96.10%），顯著高于未成熟樹突狀細胞，為成熟樹突狀細胞表面標志物特點。

2.3 MLR能力 未成熟樹突狀細胞組和成熟樹突狀細胞組均能誘導同種異體混合淋巴細胞發生增值（P<0.05），其能力與樹突狀細胞濃度為明顯正比，見圖5。

圖 5 鼠BMDC刺激同種異體混合淋巴細胞增殖反應

3討論

樹突狀細胞在組織中廣泛分布，但提取困難且數量少，所以尋求一種方法體外培養并得到一定數量的有功能的樹突狀細胞就很有必要[3]。鑒定一種細胞是否為樹突狀細胞，現通用鏡下形態、表現特異性標志和MLR水平來判 斷[4]，而且其還應該表達CD33、CD80、CD86等標志物。

現階段常用培養并提純樹突狀細胞方法主要有：①磁珠篩選：即依照樹突狀細胞表面標志進行篩選，但實際上樹突狀細胞并無表面特異性標志，故篩選方法、流程復雜，且花費高昂。最后得出的樹突狀細胞數量亦不盡人意。②體外誘導、擴增：通過本研究方法得出的樹突狀細胞，在形態上可見明顯的樹突樣特點；流式細胞儀檢測顯示細胞表達較高水平的表面分子；而MLR則更進一步說明其有刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力。

綜上所述，此是目前階段較好的培養、擴增樹突狀細胞的實驗方法。

參考文獻：

[1]Adams S， O'Neill DW， Bhardwai N. Recent advances in dendritic cell biology.[J].Clin Immunol 2005；25（3）：177-188.

[2]The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China.Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals.2006-09-30.

[3]Sun Y， Ding L， Zhang H， et al. Potentiation of Smad-mediated transcriptional activation by the RNA-binding protein RBPMS.[J]. Nucleic Acids Res，2006，34（21）：6314-26.

[4]Xu H， Chen T， Wang HQ， et al. Combination treatment with donor interleukin-12p35 silenced dendritic cells and cyclosporine induces long-term survival of intestinal allografts in rats.[J].Transplant Proc 2007；39（1）：286-288.

[5]Dziembowska M， Dan ilkiew iczm， Wesolowaka A， et al. Cross talk between Smad and p38MAPK signaling in transforming growth factor beta signal transduction in human glioblastoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，354（4） ：1101-06.

編輯/肖慧