硼替佐米對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響

摘要：目的 通過硼替佐米作用于前列腺癌細胞體外增殖及凋亡的實驗研究，初步探討硼替佐米治療前列腺癌的機制。方法 體外培養DU145細胞，使用不同濃度硼替佐米分別作用于DU145細胞24、48、72 h，CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖，Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡率。流式細胞術檢測DR5、Fas蛋白的表達。結果 硼替佐米作用后，隨劑量增加，DU145細胞存活率逐漸下降，凋亡細胞逐漸增多，與對照組相比，至藥物濃度為15 nmol/L 時有顯著差異（P<0.05），同時硼替佐米處理細胞后，DR5、Fas蛋白的表達明顯增加（P<0.05）。結論 硼替佐米能夠有效抑制前列腺癌細胞增殖并促進其凋亡，且這種作用可能與增加DR5、Fas蛋白的表達有關。

關鍵詞：硼替佐米；DU145細胞；人類前列腺癌；DR5；Fas

前列腺癌是一種極易發生侵襲和轉移的男性泌尿生殖系統腫瘤。激素非依賴性前列腺癌臨床上尚無一種有效的治療手段，現在正期待著有效的治療藥物的產生[1]。硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，曾有研究也驗證了硼替佐米在實體瘤的應用[2]，但硼替佐米對激素非依賴性前列腺癌細胞的增殖和凋亡的影響的研究較少，本文擬用激素非依賴性前列腺癌細胞系DU145驗證硼替佐米對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能機制。

1資料與方法

1.1一般材料 硼替佐米（Millennium Pharmaceuticals，USA），細胞毒性檢測CCK-8試劑盒（Dodindo，Japan）；Annexin V/PI凋亡試劑盒（南京凱基試劑公司，China）。

1.2方法

1.2.1細胞培養方法及條件 DU145細胞用含10%的FBS的RPMI 1640培養基，在37℃、5% CO2的培養箱中培養，細胞呈單層貼壁。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 DU145細胞37℃，5% CO2條件下培養24h。細胞貼壁后，各實驗組分別加入不同濃度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米。繼續培養24、48、72h。DU145細胞用完全培養基作為陰性對照孔，每孔加入CCK-8溶液10μl，繼續培養2h，在酶聯免疫檢測儀OD 450 nm處測量吸光值。細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 DU145細胞種入6孔板中，貼壁24 h。不同濃度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米處理DU145細胞24 h，用AnnexinV- FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測測定處理后細胞的凋亡情況。

1.3統計學分析 所有數據均為3次獨立實驗結果，以均值士標準差（x±s）表示。采用SPSS11.5軟件進行統計學分析。兩組之間比較采用t檢驗，多個樣本之間進行方差分析，P<0.05具有統計學意義。

2結果

2.1硼替佐米抑制了DU145細胞的增殖 DU145細胞暴露于不同濃度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米后24、48、72 h后，用CCK-8法分析腫瘤細胞的增殖情況。細胞在用硼替佐米15或20 nmol/L的濃度孵育48 h后顯著的降低了增殖活性，見表1。

2.2硼替佐米能夠誘導DU145細胞凋亡 DU145細胞暴露于不同濃度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米24 h， Annexin-V/propidium iodide法分析凋亡情況。在用15 nmol/L或更高濃度的硼替佐米處理后，DU145細胞顯示了很明顯的凋亡增加，見圖1、表2。

圖1 硼替佐米對前列腺癌細胞DU145凋亡的影響

2.3硼替佐米對DU145細胞DR5蛋白表達水平的影響 DU145細胞暴露于0 nmol/L或20 nmol/L硼替佐米24 h，流式細胞術檢測蛋白表達水平。結果顯示，隨著硼替佐米濃度的增加，DU145細胞顯示了明顯的DR5蛋白表達水平的增加，見圖2。

圖2 硼替佐米對DU145細胞DR5 蛋白表達水平的影響

注：灰線為未處理組，黑線為20 nmol/L硼替佐米處理組。

2.4硼替佐米對DU145細胞Fas蛋白表達水平的影響 我們將DU145細胞在正常條件下培養或用20 nmol/L硼替佐米處理24h后用PE連接的抗Fas抗體標記細胞。用流式細胞儀分析Fas蛋白在細胞表面表達水平。發現硼替佐米處理后，上調了DU145細胞表面Fas蛋白的表達水平，見圖3。

圖3 硼替佐米對DU145細胞Fas蛋白表達水平的影響

注：灰線為未處理組，黑線為20 nmol/L硼替佐米處理組。

3討論

26S蛋白酶體是一種復雜的酶類，在所有的真核細胞胞核和胞漿中表達，通過泛素連接來降解靶蛋白[3]。蛋白酶體對維持內環境的穩定起了重要作用。這些作用使它成為了一種有潛力的腫瘤治療靶點[4]。本研究我們證明了在激素非依賴性前列腺癌細胞中，硼替佐米以濃度和時間依賴的方式抑制了DU145細胞的生長。并證明了>15 nmol/L濃度時硼替佐米能夠顯著的誘導前列腺癌細胞的凋亡。

據報道，蛋白酶體抑制參與大范圍的細胞效應，包括NFκB的活化[5]、減少c-FLIP的表達，累積前凋亡蛋白Bik，通過細胞內的凋亡通路活化caspase-3等[6]。為了驗證硼替佐米是否也能通過外源性凋亡途徑促進腫瘤細胞的凋亡，在這里，我們發現硼替佐米處理后的DU145細胞死亡受體DR5和Fas的蛋白表達水平明顯增加 。這證明了硼替佐米可部分通過增加死亡受體DR5和Fas的表達來誘導前列腺癌細胞的凋亡。通過本研究，我們可以更深刻的認識硼替佐米的抑瘤作用，為激素非依賴性前列腺癌的治療提供新的策略。

參考文獻：

[1]Popiolek M， Rider JR， Andrén O， et al. Natural history of early， localized prostate cancer： a final report from three decades of follow-up. Eur Urol. 2013， 63（3）：428-435.

[2]Blaney S M， Bemstein M， Neville K， el al. Phase 1 study of the proteasome inhibitor bortezomib in pediatric patients with refractory solid tumor：a Children's Oncology Group study. Clin Oncol. 2004；22（23）：4804-4809

[3]Pickart C M. Back to the future with ubiquitin. Cell. 2004；116：181-190.

[4]Goldberg A L， Stein R， Adams J. New insights into proteasome function： from archaebacteria to drug development. Chem Biol. 1995；2：503-508.

[5]Zwickl P. The 20s proteasome. Cur Top Microbiol Immunol. 2002； 268：23-3l

[6]Kloetzel P M. Antigen processing by the proteasome.Nat Rev Mol Cell Biol. 2001； 2（3）：179-187.編輯/肖慧