慢性氟中毒誘發大鼠腎臟損傷機制的研究

摘要：目的 探討慢性氟化鈉中毒大鼠腎臟損傷的作用機理。方法 通過給大鼠自由飲用含有不同劑量氟化鈉煮沸冷卻自來水4個月，制備慢性氟中毒模型，測定其血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，同時檢測各組大鼠腎臟總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。結果 氟化鈉慢性中毒各組尿氟和血氟含量均比正常對照組增高（P<0.01），并且中、高劑量組大鼠血清BUN、Cr活性增高（P<0.01）；氟化鈉各劑量組大鼠腎臟MDA含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），S0D和T-AOC活性顯著下降（P<0.01），同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01）。結論 自由基水平增高誘發脂質過氧化可能是氟致大鼠腎臟損傷的重要機制之一。

關鍵詞：氟化鈉；慢性氟中毒；腎臟；自由基；脂質過氧化；大鼠

長期以來，氟中毒主要損害牙齒、骨骼等骨性組織已十分明確，而對內臟的損害卻未能引起起臨床學和病理學醫生的重視。氟是機體重要的微量元素之一，但攝入過量能引起廣泛的全身性病變，其作用機理至今尚不清楚。近年來，氟中毒引起的非骨相損害越來越引起國內外學者的關注，慢性氟中毒是嚴重危害人類健康的全身性疾病，腎臟是氟排除的主要器官，也是氟中毒的靶器官之一，但氟中毒的病理機制十分復雜，目前尚無一致的解釋。有研究報道，氟中毒的病理機制可能與其在機體造成自由基堆積、氧化損傷增強，抗氧化酶活性降低有關[1，2]。機體慢性氟中毒時內臟組織病理損傷可能與氟誘導機體脂質過氧化作用增強有關[3]，但脂質過氧化在氟中毒腎臟損傷中的作用機制有待進一步研究。本實驗通過制備大鼠氟化鈉慢性中毒模型，檢測氟中毒大鼠血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，并觀察腎臟脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的變化，進一步探討腎臟損傷與脂質過氧化或者自由基之間的關系，為深入研究氟中毒腎臟病變提供科學依據。

1 資料與方法

1.1實驗動物 健康Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體重（100±10）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYKG桂2003-0005。動物室溫度：（25±2）℃，相對濕度：（60±5）%。動物以廣西醫科大學醫學實驗動物中心配制的飼養。

1.2主要藥品和試劑 氟化鈉（北京化工廠生產，批號：070703）；尿素氮測定試劑盒（批號：20091114），肌酐測定試劑盒（批號：20091114），均為長春匯力生物技術有限公司產品；總抗氧化能力測定試劑盒（批號：20090918），丙二醛測定試劑盒（批號：20090918），超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：20090905），谷胱甘肽測定試劑盒（批號：20090905），考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號：20050723）測定，均為南京建成生物工程研究所產品。

1.3主要儀器 電熱恒溫水浴（北京長安科學儀器廠）；低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；日本東芝TBA-120FR生化分析儀（日本東芝公司產）；722S分光光度計（北京長源實驗設備廠）；漩渦混合器XW-80A（上海醫科大學儀器廠）；電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）。

1.4動物分組 健康Wistar大鼠60只，隨機分為四組，每組15只，分別分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組電針治療組。其中低、中、高劑量組大鼠分別自由飲用有含氟化鈉55、110、222mg/L的煮沸冷卻自來水，空白對照組大鼠自由飲用煮沸冷卻自來水。給藥期間稱體重1次/2w，并觀察一般狀況，有無死亡等情況，實驗周期共4個月。

1.5指標觀察與測定 實驗結束后前1d收集大鼠24h的尿液，以待測定尿氟含量；各組大鼠采用摘除眼球取血，靜置后3000r/min離心15min分離血清，采用采用氟離子選擇電極法測定尿氟、血氟含量，采用生化分析儀檢測BUN、Cr。頸椎脫臼處死大鼠，取腎臟剪碎后加入9倍生理鹽水在冰浴中制成10%（W/V）腎臟勻漿組織液，3000r/min離心15min分離上清液，于-20℃保存待測；分別采用分光光度法組織中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量，均采用南京建成生物工程研究所產品試劑盒，具體操作步驟嚴格按照均按照說明書操作測定。

1.6數據統計 統計計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，所有數據均在計算機中由SPSS13.0統計軟件處理。

2 結果

2.1一般狀況 空白對照組和低劑量組大鼠活動正常，體重增長正常，毛色光澤；而中、高劑量組大鼠安靜少動、體重體重增長率隨染毒劑量增加呈降低趨勢，飲水量偏多，部分大鼠毛色無光澤。空白對照組大鼠門牙呈棕黃色，表面色澤光滑；中、高劑量組所有大鼠門齒均發生了氟斑牙，表面粗糙，光澤偏黃色，重者甚至發生牙齒缺損。實驗期間，正常對照組雌性大鼠死亡1只；中劑量組雄性大鼠死亡2只；高劑量組雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化鈉慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量變化 實驗結果顯示，3個月后氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明氟化鈉慢性中毒模型建立成功。而且隨著染氟劑量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有劑量-反應關系，見表1。

2.3氟化鈉慢性中毒大鼠血清轉氨酶變化 實驗結果顯示，與正常對照組相比，氟化鈉中、高劑量組大鼠BUN、Cr濃度水平顯著升高（P<0.01），表明慢性中毒過程中氟化鈉誘發大鼠肝臟損傷，見表2。

2.4氟化鈉慢性中毒大鼠腎臟脂質過氧化的改變 實驗結果顯示，給予氟化鈉3個月后，氟化鈉各個劑量組大鼠肝臟中脂質過氧化產物MDA具有顯著性增高（P<0.05、P<0.01），且與劑量的增加呈現一定的正比關系；而SOD和T-AOC隨著氟化鈉劑量的增加而顯著性降低（P<0.05、P<0.01），表明機體抗氧化能力作用減弱。同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01，P<0.05），見表3。

3 討論

本實驗采用不同濃度的含氟水喂飼大鼠4個月后，氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量均顯著高于正常對照組，表明已成功地復制出了氟中毒大鼠模型。腎臟在維持機體內環境穩定方面發揮著重要的功能。由于肝臟和腎臟特別是腎臟是動物和人體氟排泄的主要器官，也是氟中毒的重要靶器官之一[4]。血清BUN和Cr濃度在一定程度上可反映腎小球濾過率功能的損害程度，是常用的腎功能指標。實驗結果顯示，經過4個月的喂養后，各組大鼠血清BUN和Cr濃度升高（P<0.01），說明氟化鈉各劑量組大鼠腎功能均受到損傷。

慢性氟中毒是一種全身性疾病，可導致氟在體內蓄積，引起氟中毒，過量氟進入機體除了累及牙齒和骨組織外，對非骨相組織和器官亦能產生損害作用[2]。地氟病發病機理尚未完全闡明清楚，自由基代謝紊亂引起的氧化應激性損傷在地氟病的研究中一直是個熱點，發病機制仍很不清楚。近年來，自由基在疾病發生中的作用越來越多地受到重視。研究發現慢性氟中毒與自由基損傷密切相關，提出自由基損傷是慢性氟中毒發病機制的中心環節[5-7]。 氟作為一種化學性質極活潑的元素，在體內外均可形成自由基，或者可通過過量的氟干擾機體的正常抗氧化機制，產生過多的氧自由基而損傷膜系統，造成脂質過氧化物的增多和清除自由基的酶活性降低[8]。在正常情況下，體內氧自由基的產生和清除是平衡的，一旦氧自由基產生過多或抗氧化體系出現故障，體內氧自由基代謝就會出現失衡，或稱氧化應激[9]。活性氧自由基可以與機體內多種生物分子發生反應，破壞正常組織的結構和功能，造成組織細胞生物膜、蛋白質、核酸等損傷。

由于脂質過氧化可造成組織細胞的嚴重損傷，故機體內存在很強的抗氧化系統，包括GSH和VitE等非酶性抗氧化物質及SOD和GSH-Px等抗氧化酶系兩部分，外源性毒物可以通過抑制體內抗氧化酶系活性或消耗抗氧化物質而導致脂質過氧化作用增強[10]。體內抗氧化系統能力的降低是脂質過氧化產生的前提，過氧化肝損傷時機體組織不僅MDA含量可增高，還導致SOD活力下降和GSH含量降低引。MDA是體內自由基攻擊脂質產生脂質過氧化物的代謝最終產物，并可對細胞產生進一步破壞作用，MDA不僅是反映脂質過氧化的敏感指標，還可間接反映出細胞損傷的程度。而SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷，其活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力。因此，MDA的測定常常與SOD相互配合分析機體內脂質過氧化代謝情況。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的催化下接受大量電子氧化成二硫化谷胱甘肽（GSSG）的同時減少了過氧化氫及脂質過氧化物的形成，因此，GSH可作為評價氧自由基脂質過氧化損傷的較敏感的指標[11]。本實驗觀察到慢性氟中毒太鼠腎臟MDA含量增高、SOD活性降低，血清尿素氨含量明顯高于正常對照組，表明腎功能損傷，提示腎功能損傷與SOD活性降低，MDA含量增多有關，提示慢性氟中毒時腎臟損傷與自由基有密切關系，這也和文獻報道的相一致[12，13]。此外，實驗中還觀察到GSH和T-AOC含量顯著性降低（P<0.01），提示慢性氟中毒時機體抗氧化能力降低，脂質過氧化物的生成。高勤等[7]采用ESR法直接檢測慢性氟中毒大鼠腎組織內自由基含量的變化，證實了氟中毒時腎組織內自由基增多的事實。

上述事實表明，腎臟的損傷與其中的氟含量有密切的關系。過多的自由基，攻擊細胞生物膜，引起脂質過氧化過程加強，造成腎臟細胞損傷。再次論證，氟中毒時自由基增多誘導的脂質過氧化是導致腎臟組織損傷的主要機制之一。本研究結果為預防和治療地氟病患者提供了科學依據，但其確切機理還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]郭曉英，孫貴范，孫憲民，等.氧化應激在亞慢性氟中毒大鼠肝臟損傷中的作用[J].中國公共衛生，2003，19（5）：575-576.

[2]郭曉英，陳愛莉，孫責范.氟對大鼠肝臟氧化應激及超微結構的影響[J].中國醫科大學學報，2005，34（4）：321-322.

[3]劉戎，魏鳳輝，宣照林.自由基與氟中毒[J].中國地方病防治雜志，2003，18（6）：353-355.

[4]于琳華，張富軍，張增鐵，等.過量氟對大鼠腎肝心損害的形態學研究[J].中國地方病學雜志，2001，20（2）：104-106.

[5]徐輝，張秀云，張桂珍，等.氟中毒大鼠腦組織自由基的變化[J].中國地方病防治雜志，2000，15（6）：324-325.

[6]井玲，邵宗俊，任立群，等.氟中毒大鼠肝細胞凋亡研究[J].中國地方病學雜志，2000，18（2）：84-86.

[7]高勤，王守立，于燕妮，等.自由基在慢性氟中毒大鼠腎臟損傷中的作用[J].中國地方病學雜志，2001，20（2）：94-97.

[8]張傳強，哈斯蘇榮，關紅，等.五種抗氟中草藥復方的藥效比較研究[J].實驗動物科學， 2007，24（2）：14-17.

[9]孫玉富.自由基與氧化應激及其在地方性氟中毒發病中的作用[J].中國地方病防治雜志，2003，18（1）：37-40.

[10]高勤，王守立，于燕妮，等.慢性氟中毒大鼠腎臟自由基含量與形態學變化[J].貴州醫藥，2005，29（3）：213-215.

[11]宋玉果，王滌.谷胱甘肽作為脂質過氧化損傷指標的研究[J].中華預防醫學雜志，1999，33（5）：317-319.

[12]梁剛，孫貴范，李影奕，等.氟對大鼠脂質過氧化和抗氧化能力的影響[J].中國地方病學雜志，2001，20（2）：109-110.

[13]陳楊，于燕妮，呂學霞，等.氧化應激在燃煤污染型氟中毒大鼠中的作用[J].中國實用醫藥，2008，3（4）：1-3.

編輯/哈濤