三維調控光纖激光引導PC12細胞突起定向生長

摘要：目的 本實驗采用創新設計的光纖激光束引導裝置，精確引導單個PC12細胞突起的定向生長，探求光纖引導低能量激光精確控制神經細胞突起在體外定向生長的新方法。方法 選取體外培養突起生長活躍的PC12細胞為研究對象，將光纖末端經拉制后固定于三維微操上。波長為800nm的激光束經光纖引導投射在靶區域，引導過程中光纖隨突起的生長而移動，始終與突起的生長方向保持近似垂直位。每隔5min拍攝一張照片，連續觀察30min。結果 30例突起生長活躍的PC12細胞中，20例細胞突起的生長方向可在5min內被波長為800nm的激光影響。在30min的照射中，13例PC12細胞的突起跟隨光纖激光束生長，偏轉角度在60°及以上的有6例，最大偏轉角度可達100°以上。結論 本引導裝置可影響PC12細胞突起的生長方向，引導其細胞突起跟隨激光生長，為光纖引導低能量激光精確控制神經細胞突起在體外定向生長的提供了一種新方法。

關鍵詞：醫學光學；光纖；激光；PC12細胞；生長錐

神經再生修復過程中，再生神經元網絡的結構重建關系到神經功能的再生。神經元突起定向生長沿一定路徑最后到達靶位，并與下一個神經元形成正確的突觸連接過程主要依賴于神經纖維最前端生長錐的活動。生長錐的活動受一系列微環境信號的調控，局部微環境的各種化學或電信號等改變是引導神經細胞定向生長的主要體內因素。在體外培養條件下，突起沿著黏附性最佳的表面前進的特性決定了神經元的網絡結構[1]，如體外培養的Neuroblastoma-glioma細胞突起可以沿培養皿表面劃痕或沿血漿凝塊張力線定向生長。電場對軸突亦具有引導作用，Patel等的實驗顯示電壓梯度廣泛存在于發育中的胚胎，并影響著胚胎中軸突的生長[2]。近期研究發現，激光作為一種非接觸性的操控方式，也能引導神經細胞生長錐的生長方向。A Ehrlicher等學者采用倒置激光共聚焦顯微鏡對生長中的神經元軸突進行掃描，引導生長錐的生長[3]。該系統由激光器發射激光后經光路耦合，在倒置激光共聚焦顯微鏡的載物臺中央形成激光陷阱，通過操縱激光陷阱位置成功引導生長錐的生長方向[4]。朱天淳等學者采用倒置式激光陷阱置于PC12細胞的生長錐前方來引導生長錐的生長方向，通過對生長錐施以持續作用力，成功引導了神經細胞生長錐的生長方向，引導成功率達65%[5]。然而傳統激光陷阱具有體積大、工作距離短，不宜實現多光鑷耦合等缺點，使其更廣泛的應用受到限制。而光纖技術克服了上述缺點，以其簡單的結構，低廉的價格，光全反射的特性，微/納米尺度的操控能力等優點，越來越受到研究者們的廣泛重視。

本研究擬采用創新設計的光纖激光束引導裝置，通過調控三維微操將直徑為納米級的光纖末端定位于生長錐一側，精確引導PC12細胞單個突起的生長，為光纖引導低能量激光精確控制神經細胞突起在體外定向生長尋求新方法并提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1試劑與溶液 L -多聚賴氨酸、胰蛋白酶、谷氨酰胺；高糖DMEM，青霉素-鏈霉素；馬血清，胎牛血清；其他試劑均為國產分析純。所用溶液包括PBS 0.25%胰蛋白酶，PC12細胞培養液。PC12細胞分化培養液。谷氨酰胺在使用前加入到培養基，終濃度為2mM。

1.2細胞培養 PC12細胞株以含10%馬血清，5%胎牛血清的PC12細胞培養液維持生長，細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待單層培養細胞生長至80%匯合后，0.25% 胰蛋白酶消化，以2×104個/cm2的密度接種于L-多聚賴氨酸包被過的培養皿，進行傳代培養。并用PC12細胞分化培養液誘導細胞分化和突起的生長。在倒置相差顯微鏡下定時觀察，記錄細胞貼壁以及神經細胞突起的生長情況。

1.3激光引導 光纖激光束引導裝置：本實驗自行設計組裝的光纖激光束引導裝置主要由紅外激光發射器、光纖、三維微操系統，以及包括對可見光和紅外線敏感的電子成像設備組成（圖1）。激光發射器參數：全固態半導體激光器，波長 808nm，功率500mw。光纖參數：陶瓷插芯光纖跳線，型號FC/PC-FC/PC-2～3.0mm-MM-3M，光纖代碼62.5/125um，插入損耗≦0.3dB，回波損耗≧35dB。實驗中電子成像設備由倒置顯微鏡的顯微成像系統所組成，通過將其與電腦連接，實驗人員可以在計算機屏幕中實時記錄神經細胞突起的生長軌跡，監控激光引導實驗的過程。

圖 1 光纖激光束引導裝置三維結構示意圖

1.4激光引導方法 選取突起生長旺盛的PC12細胞用于激光引導實驗，將目標細胞移至視野中央，光纖固定于三維微操之上，通過操作微操將光纖尖端放置在細胞生長活躍的突起一側，使激光束照射方向與突起自然生長方向垂直，呈約90°（圖2）。倒置顯微鏡下觀察，通過顯微照相系統每隔5min拍攝一張圖片，連續觀察30min，記錄神經細胞突起在激光引導過程中的生長軌跡。

圖 2 顯微鏡下激光束方向與生長錐原始生長方向相對位置的示意圖（a）和照片（b）。

突起生長過程中，由于激光以及其他因素的影響，其生長方向與位置會時刻發生變化，因此每隔2min，光纖末端的位置也需隨著神經元突起的方向與位置移動，使激光照射方向與突起始終保持在近似垂直位。但是光纖末端在定位或者移動過程中始終不能接觸細胞和突起的任何部位以及培養皿的表面。同時在激光引導的整個過程中最大程度遮蔽自然光，關閉其他光源，以排除成分復雜的自然光或者燈光的干擾。

1.5數據處理 實驗中所有拍攝的圖片均由OLYMPUS顯微照相機拍攝。放大倍數400×；像素4080×3072；大小：高×寬=18cm×23cm。照片首先均由Adobe Photoshop CS5 進行初步剪切，調色處理，處理后圖片大小為：高×寬=1.8cm×2.3cm。最后測量統計突起生長狀況和偏轉角度。

2 結果

2.1 PC12細胞形態學觀察 PC12細胞接種初期，細胞呈圓形，無突起，光暈明顯，分布均勻。接種12h后細胞基本貼壁，先前分散的細胞呈現抱團生長，部分細胞可觀察到細胞突起生長（圖3-a）。24h后，大部分細胞可見突起生長，有的突起較長且增粗，末端膨大呈傘狀，其上有若干偽足時刻變換形狀與位置（圖3-b）。在倒置顯微鏡下連續觀察20min，可見部分突起生長了近5μm。接種48h后，可見PC12 細胞出現多個突起，數目不等，其中有較長、直徑較粗，類似神經元軸突樣突起，其長度可達PC12細胞胞體直徑的2～3倍，可見PC12細胞已成功向神經細胞樣分化（圖3-c）。

圖 3 接種后的PC12細胞

注：a、b、c分別為接種12h、24h、48h后PC12細胞（Scale=20μm）

2.2激光引導實驗結果 選取30例胞質均勻、立體感強、突起完好、生長旺盛接種24h后的PC12細胞用于光纖激光引導實驗。顯微照相系統每隔1min拍攝一張照片，連續觀察30min，記錄細胞突起的生長軌跡。

如表1、圖4所示，在激光引導過程中67%生長活躍的突起都可以在5min內被波長為800nm的激光影響。若以偏轉角度（突起偏離原始生長方向的角度） 大于10°為低限，則20例中有13例PC12細胞的突起跟隨光纖激光束生長（圖5-a、b）。其中，偏轉角度在30°以下的有7例，偏轉角度在30°～60°的有4例，偏轉角度在60°及以上的有2例，其中最大偏轉角度可達100°以上。

除突起跟隨激光束生長外，實驗中亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生長（圖5-c）或者突起向胞體方向回縮的現象，分別占10%（3例）和13%（4例）。同時，在30例細胞中有33%（10例）細胞突起的生長不受光纖激光束的影響，在激光引導的30min內既不跟隨激光束，也不背向激光束，而是依據其原始的生長方向繼續生長或停止生長。

圖 4激光對PC12細胞突起生長引導結果（Scale=20μm）

注：每一組中的五張照片分別在激光照射后即刻、6min、12min、21min、30min的拍攝。

如圖所示，a、b為兩例突起跟隨光纖激光束生長的PC12細胞。照片顯示了激光引導突起偏轉的過程。a、b2例突起偏轉角度均大于45°，a偏轉大于90°。c為1例突起在激光照射后背向激光束引導方向生長PC12細胞。

3 討論

\"激光陷阱\"（optical traps）又名\"光鑷\"（optical tweezers ），可以實現對生物活體樣品非接觸無損傷的捕獲和操縱，自誕生至今20多年以來，廣泛應用于微觀科學領域 。激光陷阱由激光發射裝置發射一定波長和頻率的激光，穿過倒置顯微鏡下方的物鏡在載物臺形成一個類似光環的陷阱。在其光路傳輸過程中，經物鏡，空氣，培養皿底等介質的反射與折射，存在不同程度的能量消耗。

本實驗光纖激光引導裝置與傳統激光陷阱最大的區別在于，其激光束不再通過顯微鏡物鏡本身的光路途徑到達載物臺，而是通過光纖引導投射于靶區域。實驗中光纖激光束引導裝置采用NARISHIGE三軸水壓微操鏈接光纖夾持器，通過對微操的調節，控制光纖末端的位置、角度、以及它的運動，準確放置在神經細胞生長錐附近的任意區域，使激光束通過光纖末端傳導精確定位于生長錐附近的靶區域內，引導其定向生長。實驗所配置的光纖夾持器滿足了光纖微/納米級的移動以及其良好的穩定性。

已有的研究證明780～830nm紅外線波長的激光對神經的修復再生具有較好的生物刺激作用。本實驗中光纖激光引導裝置所采用的激光發射器可產生波長為800nm，能量在0～500mw范圍內的激光，激光強度通過調節旋鈕調整，并實時在激光發射器的屏幕上顯示當前的激光強度。實驗所采用的光纖可傳輸波長為（800±50）nm，能量在0～150mW范圍內。為使引導方向更加精確，光纖尖端被拉制成為錐形，其末端直徑經測量約為5～10μm，與神經元生長錐直徑相宜。同時光纖具有的光全反射特性，使其傳導最大程度上保留了激光的能量，減少了激光束自激光發射器產生至投射于生長錐這一傳輸過程中的能量損耗，便于在引導實驗過程中更為精確地控制激光強度。此外，光纖引導完全脫離顯微鏡本身的物鏡光路途徑，擺脫固定光路的束縛，使引導更為靈活。其在三維空間中的自由度為構建以及修復活體組織中復雜的神經網絡提供了可能。

當生長錐某區域被激光束照射時，激光束自光纖末端發出后呈扇形輻射在這一區域。根據Ehrlicher等學者的實驗，分布在生長錐此區域邊緣的激光強度必須足夠大，方能引起肌動蛋白聚合反應，使生長錐朝此方向偏轉[1]。但是為了控制突起生長的方向，生長錐需持續跟隨激光束生長，所以突起的生長不需要過多的聚合反應，大量的聚合反應將阻礙生長錐的進一步生長。因此掌握生長錐邊緣特定區域內激光的輻射強度，是成功引導生長錐跟隨激光引導方向生長的關鍵。本實驗中當激光強度小于1mw時，生長錐往往不容易被激光引導，當激光強度大于5mw，約5min之內， 生長錐被激光束照射的區域將變厚或者密度增加（可在光鏡下觀察到生長錐此部分顏色加深的畫面），生長錐開始改變原有生長方向。如果繼續增加激光強度至45mw時，這一區域生長錐生長將停滯。且光纖激光引導結果中，除突起跟隨激光束生長外，亦存在突起在激光照射后背向激光束的方向生長或者突起向胞體方向回縮的現象。

光纖末端的直徑大小是激光精確引導的關鍵因素。若光纖末端直徑過大，激光束在光線末端將產生一個較大的散射角，在實驗中常常會覆蓋整一個生長錐，引導效果將難以控制。若選擇末端直徑較小的光纖，它自身重量和液面張力會使光纖彎曲，同時，在微操調節光纖位置時，輕微的震顫都將引起光纖末端的\"大幅度搖擺\"，相對于脆弱的細胞而言這無疑是極大的破壞。因此本實驗選用直徑為125μm的silica光纖，經測試，其硬度適宜。在放大鏡下剝去光纖末端1cm的保護套后，于酒精燈上拉制，使其末端呈錐形且錐形尖端直徑在5～10μm。激光的折射率在空氣中為1，在水中為1.3，在富含各種營養物質的DMEM培養液中折射率更高。并將光纖浸入細胞培養液，測量波長為800nm的激光經光纖傳導投射在培養液中的散射角度，約為（90°±10°）。

圖 5 顯微鏡下光纖錐形尖端及激光束

注：如圖所示為激光經光纖錐形尖端傳導，投射在培養皿底部的扇形區，其投射的扇形散角為90°±10°。圖中激光的強度被增強，使扇形投射區可以清楚顯現。

由于光纖末端不能接觸生長錐邊緣任何區域，它必需與生長錐邊緣存在一定距離，激光在這段距離的培養液中存在一定的能量損耗。因此激光束扇形輻射的各個區域內，激光強度皆不相同，生長錐處于扇形內不同區域可能會產生不同的反應。如本實驗中出現的突起跟隨、背向激光引導方向生長以及突起回縮等引導結果。

生長錐生長及轉向通過神經細胞內細胞骨架的活動來實現。光纖激光引導神經細胞突起定向生長的機制尚無定論。依據目前研究可知，光纖激光束引導裝置所產生的光作用力可分為兩部分：一種是梯度力，將粒子拉向光場增強的方向；另一種是散射力，將粒子推向光傳播的方向。光纖激光束裝置的激光發射器產生波長為800nm的激光，耦合于光纖傳輸。光纖的末端經拉制后呈尖端口徑為5～10μm的錐形，激光從錐形末端輸出，作用于生長錐。該錐形光纖相當于傳統光鑷中的顯微物鏡，將光束會聚。但錐形光纖的徑向方向，光場梯度力仍起主導作用，作用力指向軸線。生長錐內肌動蛋白微粒受激光梯度力和散射力的影響在生長錐邊緣聚集，從而發生聚合和解聚反應，使生長錐偽足朝激光方向延伸，生長錐跟隨激光生長。

另外具有一定能量的光子激光照射在生長錐上會引起局部溫度上升，溫度是否是激光引導生長錐偏轉的原因？有研究表明：波長為800nm的激光在水中或者DMEM中連續照射僅僅引起局部溫度較小的上升，與環境溫度相比甚至可以忽略不計[4]。因此，激光照射過程中，生長錐局部溫度的變化可能不是引起生長錐受激光影響而偏轉的原因之一。

總之，本實驗通過創新設計的光纖激光束引導裝置將波長為800nm的激光通過光纖引導投射于PC12細胞生長錐的一側，精確引導其生長方向。結果提示該光纖激光引導裝置可以用于引導神經細胞突起的定向生長，且引導方向精確，結構簡單靈活，其在三維空間中的自由度亦為構建以及修復活體組織中復雜的神經網絡提供了可能。

參考文獻：

[1]Kaehr B， Allen R， Javier DJ， et al. Guiding neuronal development with in situ microfabrication [J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（46）：16104-8.

[2]Patel N， Poo MM. Orientation of neurite growth by extracellular electric fields [J].J.Neuroscience，1982， 2（4）：483-496.

[3]Ehrlicher A， Betz T， Stuhrmann B， et al. Guiding neuronal growth with light[J]. Proc.Natl.Acad.Sci，2002，99（25）：16024-16028.

[4]朱天淳，馮秀舟，方建興，等.激光陷阱引導神經細胞生長方向的研究[J].激光雜志，2006，27 （4）：37-38.

[5]喬曉艷.弱激光對神經元離子通道的影響及其電流檢測方法[D].天津：天津大學精密儀器與光電子工程學院，2006.編輯/哈濤