呼吸道病毒檢測方法的臨床研究

摘要：近幾年的流行病學調查結果已經真實，95%的上呼吸道感染、大部分的下呼吸道感染疾病均為細菌外病原所引起，其中以病毒感染最為常見，在臨床診斷中，對呼吸道病毒進行檢測的診斷意義顯著。本文出于對呼吸道病毒檢測方法的發展情況進行分析的目的，對病毒分離培養、聚合酶鏈式反應、免疫技術、酶聯免疫吸附測定法等進行了具體闡述。

關鍵詞：呼吸道感染；病毒；檢測方法；研究進展

所謂的呼吸道病毒就是在可以對呼吸道造成侵犯，誘發呼吸道局部病變，引起呼吸道組織器官病變的一種病毒。現階段的研究顯示，呼吸道病毒為人類發病與死亡的主要危險因素之一，已經引起了廣泛的關注[1]。近幾年對傳染性疾病的不斷研究中發現，病毒亞型、致病力以及患者的臨床表現均發生了較大的變化，因此對呼吸道病毒的檢測手段進行了解，并開展快速的病毒檢測手段具有很大的必要性，應引起重視。本文對現階段呼吸道病毒檢測手段的具體形式進行了綜述，詳見下文。

1病毒分離培養

對于病毒檢測工作而言，分離培養為目前最為經典的一種手段，其主要操作為[2]：對患者的鼻咽分泌物進行常規處理，接種在敏感細胞上，并在含有2%小牛血清的MEN培養基中進行生長，在37℃條件下進行旋轉培養，并對細胞的連續變化進行觀察，若是出現特征病變則視為陽性。經盲傳3代后依舊未出現病變則證實為陰性。實踐證實，盡管該手段具有較強的特異性，但是檢測成本相對較高，在早期診斷以及疫情控制中不適合。

2聚合酶鏈式反應

所謂的聚合酶鏈式反應（PCR）就是可直接對病原體核酸進行檢測的一種手段，其可以在感染的早期針對可疑病例展開及時準確的診斷。實踐中發現，傳統的PCR檢測僅可以一次從標本中檢出一種病毒，針對RNA病毒需展開逆轉錄，針對還未明確的病毒感染便無法下手，近段時間，PCR技術得到了一定的改進，包括多重實時定量PCR技術和巢式PCR技術等[3]。以下作詳細介紹

2.1多重實時定量PCR 在傳統PCR技術的基礎上將熒光標記探針予以引入，使得PCR反應與擴增產物的檢測工作可以同時完成，實現了實時定量檢測，并且閉管檢測也使傳統PCR技術需應用電泳得到了避免，減少了標本污染機會；多重PCR技術可以在同一個PCR反應體系內加入兩對或兩對以上的引物，同時可以擴增出多個核酸片段，在多種病毒的檢測中均具有良好的效果，高效且系統。曾有學者經多重PCR技術對急性呼吸道感染患兒展開了呼吸道標本中病毒檢測，結果發現陽性率為47.0%，較常規檢測方法高2倍以上[4]。

2.2巢式PCR 該項技術術語聚合酶鏈式反應的一種變異，經兩對PCR引物可擴增出完整的片段。該項技術的主要優勢為：若是第一次擴增出錯，則第2段可以在錯誤的片段上進行引物配對，擴增的概率相對較低，具有較高的特異性[5]。

3免疫技術

3.1直接免疫熒光法 對于該項技術而言，其主要原理為經熒光素對病原抗體進行直接標記，從而形成特異性熒光抗體，而后經該抗體同細胞或者是組織中的抗原進行結合。在熒光顯微鏡下進行觀察，便可以獲得結果。

3.2間接免疫熒光法 該項檢測手段的主要原理為：首先經特異性抗體同標本中的抗原進行結合，產生抗原-抗體的復合物，而后經間接熒光抗體同該復合物進行結合，形成抗原-特異性抗體-間接熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下進行觀察，以復合物的發光情況為依據對檢測的抗原進行判斷。該檢測手段的操作檢點，特異性較高，可以實現多種病毒的同時檢測，然實踐中發現，其敏感性相對較低，由于參與的組分較多，因此容易受到干擾，應引起注意。

3.3抗堿性磷酸酶橋聯酶標法 抗堿性磷酸酶橋聯酶標法（APAAP）的主要原理為第一抗體同待測抗原進行特異性的結合，而后第二抗體產生顯著的橋聯效果，其中Fab段同第一抗體連接，另一段則是與AP-AAP復合物進行連接，經AP-AAP復合物中的堿性磷酸酶催化底物進行顯色，從而達到鑒定抗原的效果。

4酶聯免疫吸附法

ELISA法為臨床上比較常用的一種檢測手段，其主要是利用將一種抗原-抗議免疫反應同酶的高效催化作用進行有機結合，通過對酶與底物的顯色反應對檢測結果進行判斷，特異性與敏感性均較高，臨床應用廣泛。

5其他技術

由于諸多新的呼吸道病毒被不斷的發現，使得實驗室檢測工作面臨著巨大的挑戰，因此開發與發展多種呼吸道病毒感染檢測技術具有很大的必要性，近幾年相繼有基因芯片技術、懸浮陣列技術等問世，其在病毒檢測中的效果還有待進一步研究，值得對其給予關注。

參考文獻：

[1]周一平，陸學東，陳小可，等.呼吸道病毒與成人下呼吸道感染相關性探討[J].中華實用診斷與治療雜志，2010，12（02）：347-349.

[2]石晶，孔曉慧.PCR技術在呼吸道病毒檢測中的應用進展[J].醫學綜述，2011，21（17）：982-983.

[3]徐軍，郭靜霞，李浩，等.不明原因呼吸道感染疫情病原學分析[J].解放軍醫學雜志，2010，35（03）：252-255.

[4]Sung RY， Chan PK， Tsen T， et al. Identification of viral and atypical bacterial pathogens in children hospitalized with acute respiratory infec-tions in Hong Kong by multiplex PCR assays[J]. Journal of Medical Virology，2009，12（14）：287.

[5] Mahony JB. Detection of respiratory viruses by molecular methods[J]. Clinical Microbiology Reviews，2011，11（04）：211-213.

編輯/許言