過(guò)表達(dá)Pitx3基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

摘要：目的 構(gòu)建并包裝大鼠Pitx3基因過(guò)表達(dá)慢病毒并建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pitx3基因的MES23.5 多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞株。方法 采用RT-PCR方法擴(kuò)增Pitx3基因片段并將其連接于含有嘌呤霉素抗性的Plv-cs2.0-N-FLAG載體質(zhì)粒，采用慢病毒包裝四質(zhì)粒系統(tǒng)（pRRE/pVSVS/pREV/pLV），用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將四質(zhì)粒按一定比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5細(xì)胞株，嘌呤霉素穩(wěn)定表達(dá)Pitx3的MES23.5細(xì)胞株，Western blotting檢測(cè)Pitx3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明在900bp處有一明顯條帶； Pitx3測(cè)序結(jié)果顯示序列與gene bank上的序列完全一致；嘌呤霉素篩選病毒感染的MES23.5細(xì)胞，傳代篩選第5代后細(xì)胞幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象；Western blotting結(jié)果顯示，在分子量為43kDa處有相應(yīng)條帶。結(jié)論 成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)Pitx3基因的慢病毒表達(dá)載體并建立了穩(wěn)定表達(dá)Pitx3基因的MES23.5細(xì)胞株，此研究為進(jìn)一步探討Pitx3基因的功能提供了良好的研究工具。

關(guān)鍵詞：Pitx3；慢病毒；載體構(gòu)建；過(guò)表達(dá)

帕金森病（Parkinson Disease，PD）是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作減少和自主活動(dòng)障礙等，主要的病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)細(xì)胞的慢性進(jìn)行性變性死亡。膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF對(duì)受損的黑質(zhì)DA能神經(jīng)細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用，如何促進(jìn)內(nèi)源性GDNF表達(dá)的增加是當(dāng)前PD治療的研究熱點(diǎn)[1，2]。

轉(zhuǎn)錄因子Pitx3屬于垂體同源盒家族成員，最初發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的骨骼肌和眼晶狀體中有表達(dá)，隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其在中腦黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)高表達(dá)[3，4]。Pitx3是維持黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)細(xì)胞存活必需的因子，在DA能神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Pitx3缺失的小鼠出生后，中腦腹側(cè)DA能神經(jīng)細(xì)胞減少，并且小鼠的運(yùn)動(dòng)能力下降[5，6]。培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞系及小鼠腹側(cè)中腦原代細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)Pitx3，均能夠明顯上調(diào)GDNF的表達(dá)量[7]。然而Pitx3調(diào)控GDNF表達(dá)的機(jī)制是什么，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究中我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了Pitx3過(guò)表達(dá)的慢病毒，并篩選出過(guò)表達(dá)Pitx3基因的穩(wěn)定細(xì)胞株，為后續(xù)研究Pitx3調(diào)控GDNF功能奠定了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株、試劑 目的基因：Pitx3，908bp，NM_019247.1。載體質(zhì)粒為pLV-CS2.0-N-Flag（抗性：嘌呤+8821bp），293T細(xì)胞株、DH5α感受態(tài)，均由廈門大學(xué)生科院陳瑞川教授饋贈(zèng)。小量和中量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ及T4DNA Ligase均購(gòu)自NEB公司。DNA引物合成和DNA片段測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，購(gòu)自Gibco公司。胰蛋白酶Trypsin 0.125%EDTA購(gòu)自SIGMA公司。DA能神經(jīng)細(xì)胞MES23.5購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Pitx3抗體購(gòu)自SIGMA公司。

1.2攜帶Pitx3的慢病毒載體pLV-N-Flag-Pitx3的構(gòu)建 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。利用Pitx3的引物（PITX3 Forward： 5'-GCGGAATTCATGGAGTTTGGGCTGCTTGGTG；PITX3 Reverse： 5'-GCGGTCGACTCAACACTGGCCGTTCCACG；下劃線分別代表酶切位點(diǎn)EcoRⅠ及SalⅠ） 擴(kuò)增目的基因Pitx3。將擴(kuò)增好的Pitx3基因和空載體質(zhì)粒pLV-CS2.0-N-Flag分別用EcoRⅠ及SalⅠ37℃雙酶切3 h后，瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切產(chǎn)物。將回收的酶切后的目的片段和載體質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌。次日挑取單菌落接種于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，250rpm，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并用EcoRⅠ及SalⅠ酶切鑒定，酶切鑒定正確的重組克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3的包裝 采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至50%～60% 時(shí)用于病毒的轉(zhuǎn)染。將上述成功連接目的基因的載體質(zhì)粒pLV-CS2.0-N-Flag和包裝質(zhì)粒pRRE/pVSVG/pREV按照2：1：1：1的比例，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞內(nèi)；轉(zhuǎn)染后的第3d收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并換上新鮮的培養(yǎng)基；第4d再次收集細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩次收集的上清混勻。將上述培養(yǎng)基1000 rpm離心5 min，棄去細(xì)胞碎片，上清液利用孔徑為0.45μm的PVDF濾器過(guò)濾至50ml離心管中。再次進(jìn)行離心（4℃、50000 rpm高速離心），小心棄去上清液并晾干，按100 ul/10cm培養(yǎng)皿的量加入DMEM（不含血清、雙抗）重懸病毒沉淀，室溫靜置2 h，然后用移液器輕輕地吹勻（避免產(chǎn)生氣泡），繼續(xù)室溫放置30min，按每次使用的病毒量分裝到潔凈的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。

1.4慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3生物學(xué)滴度測(cè)定 在滴度測(cè)定的前1d取一塊96孔板，按照每孔1×105細(xì)胞的密度接種293T細(xì)胞。加polybrene到新鮮的完全培養(yǎng)基中，使其終濃度為8μg/ml。用含有polybrene的完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒；各吸取10μl病毒稀釋液到相對(duì)應(yīng)的96孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，8h后用新鮮的完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h后，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量。一般情況下，在最高稀梯度10m的孔數(shù)出現(xiàn)N（N<10）個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則病毒滴度為N×10m×100 TU/ml（10m為稀釋倍數(shù)）。

1.5蛋白免疫印跡法（Western Blotting） 培養(yǎng)的正常和過(guò)表達(dá)Pitx3的穩(wěn)定細(xì)胞株，利用碧云天公司生產(chǎn)的蛋白裂解液裂解收集的細(xì)胞，并BCA法測(cè)定蛋白濃度，最后樣品置于100℃變性10min，離心備用。處理好的樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和抗體孵育，最后置于Odyssey儀器掃描觀察結(jié)果。

1.6慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3感染靶細(xì)胞后Pitx3蛋白表達(dá)鑒定及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MES23.5細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)進(jìn)行靶細(xì)胞感染。采用MOI值為10感染MES23.5細(xì)胞，感染72 h后，用含有終濃度為1.5 ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基傳代篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)Pitx3的細(xì)胞株，凍存?zhèn)溆谩＠^續(xù)傳代穩(wěn)定細(xì)胞株，收集細(xì)胞western blotting方法檢測(cè)Pitx3蛋白的過(guò)表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用多因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有顯著意義。

2結(jié)果

2.1成功構(gòu)建慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3質(zhì)粒 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在約900bp和9000bp處分別有明顯的基因片段；構(gòu)建出慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3質(zhì)粒，用EcoRⅠ及SalⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示在約900bp及9000bp處分別有兩條明亮的條帶；將上述酶切鑒定正確的重組克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)基因克隆完全正確，無(wú)點(diǎn)突變和缺失（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

M： Marker； 1：質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物； 2：PCR產(chǎn)物。

2.2成功包裝制備慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3及穩(wěn)定細(xì)胞株的制備 將構(gòu)建好的慢病毒載體質(zhì)粒pLV-N-Flag-Pitx3與包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)，48 h時(shí)細(xì)胞綠色熒光表達(dá)明 顯。慢病毒pLV-GFP-Pitx3的生物學(xué)滴度檢測(cè)為3.0×107 TU/ml（圖2）。

圖2 病毒上清滴度稀釋后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的熒光圖片

A：病毒上清稀釋100倍； B：病毒上清稀釋102倍； C：病毒上清稀釋103倍；D：病毒上清稀釋104倍；E：病毒上清稀釋104倍；F：病毒上清稀釋105倍。

將上述慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3和對(duì)照病毒pLV-N-GFP感染MES23.5細(xì)胞，感染48h后可見(jiàn)GFP熒光表達(dá)，72 h后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。pLV-GFP-Pitx3慢病毒按感染復(fù)數(shù)（MOI）10的感染效率較高，且細(xì)胞形態(tài)正常，死亡率較低，感染率為50%～60%。感染72 h后，細(xì)胞用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，傳代最初發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡比較多，待傳代5代以后細(xì)胞幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象，表明剩余的細(xì)胞均是含有嘌呤抗性的細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)Pitx3的MES23.5細(xì)胞株已經(jīng)被成功篩選。

2.3 Pitx3表達(dá)量的鑒定 收集培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)Pitx3基因的細(xì)胞和對(duì)照組的MES23.5細(xì)胞，Western Blotting結(jié)果顯示在43kDa 處有相應(yīng)的條帶，并且過(guò)表達(dá)細(xì)胞株中的Pitx3表達(dá)顯著高于對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)（圖3）。

圖3 Western Blotting結(jié)果顯示Pitx3蛋白表達(dá)的圖片

Control：正常的細(xì)胞； pLV： 空病毒對(duì)照組； pLV-Pitx3： 過(guò)表達(dá)Pitx3的實(shí)驗(yàn)組

3結(jié)論

為了后續(xù)探討轉(zhuǎn)錄因子Pitx3促進(jìn)內(nèi)源性GDNF的表達(dá)的機(jī)制，在此研究中我們構(gòu)建并篩選了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pitx3基因的MES23.5細(xì)胞系。首先我們構(gòu)建了攜帶Pitx3基因的慢病毒載體質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果顯示在900bp和9000bp的條帶處分別有兩條明顯的條帶，這一結(jié)果表明我們成功將目的基因和慢病毒載體成功連接，測(cè)序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了構(gòu)建的堿基序列完全正確。然后我們將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光顯著表達(dá)，表明載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒通過(guò)整合形成了完整的病毒。故我們選擇在轉(zhuǎn)染48h和64h時(shí)收集轉(zhuǎn)染的上清，因?yàn)樯锨逯邪置诔龅牟《绢w粒。最后我們將上述病毒上清感染MES23.5細(xì)胞，72h時(shí)可見(jiàn)熒光顯著表達(dá)，說(shuō)明包裝的病毒是具有感染能力的病毒，能夠很好的感染MES23.5。因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞的感染效率只有50%左右，而載體質(zhì)粒本身攜帶有嘌呤霉素抗性的基因，所以利用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選除了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pitx3的MES23.5細(xì)胞。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步顯示目的基因Pitx3在細(xì)胞內(nèi)成功獲得了高表達(dá)。

綜上所述，我們成功構(gòu)建并包裝了過(guò)表達(dá)Pitx3基因的慢病毒，并篩選出了穩(wěn)定表達(dá)Pitx3基因的MES23.5細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究Pitx3調(diào)控GDNF表達(dá)的機(jī)制奠定了很好的理論基礎(chǔ)。

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編輯/申磊