羅田板栗玫瑰紅栗實內生細菌的分離鑒定

摘要：為了探明羅田板栗新品系玫瑰紅耐貯藏的內在原因，評價其栗實中的內生細菌資源，用組織分離培養法從栗實中分離其內生細菌，并通過比對結構、生理生化特征及16S rDNA序列分析等方法對所分離的內生細菌進行鑒定。結果從玫瑰紅板栗栗實中分離得到2株內生細菌FR1和FR2，經鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

關鍵詞：羅田板栗；玫瑰紅；內生細菌；分離鑒定；16S rDNA

中圖分類號：S664.2；Q948.122.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0806-03

Isolation and Identification of the Endophytic Bacteria from Castanea mollissima ‘Meiguihong’ of Luotian County

LI Lin-ling，HUA Juan，CHENG Hua，LIAO Zhi-qin，WANG Yu-ping，YUAN Hong-hui，CHENG Shui-yuan

（Economic Forest Germplasm Improvement and Comprehensive Utilization of Resources of Hubei Key Laboratories， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： In order to explore the storage tolerance mechanism of Castanea mollissima Blume. ‘Meiguihong’， a new variety of chestnut from Luotian， and the resources of endophytic bacteria were evaulated from its chestnut. Two kinds of pathogenic bacterium， FR1 and FR2， were isolated from the decayed seeds of Chinese chestnut. These two strains were preliminarily identified as Rahnella aquatilis and Bacillus licheniformis by comparing structure， characteristics of biochemistry and physiology， sequence of 16S rDNA.

Key words： chestnut of Luotian； Meiguihong； endophytic bacteria； isolation and identification； 16S rDNA

板栗（Castanea mollissima Blume）俗稱栗子，營養豐富，風味較佳，是重要的干果品種，中國板栗的栽培面積和總產量均居世界首位。板栗對山區經濟發展和出口創匯具有重要意義。但由于其含水量高的特點，貯藏期易發生栗實腐爛，腐爛率甚至可高達50%，嚴重制約了板栗產業的發展[1]。栗實腐爛的發生機理及綠色防治逐漸成為研究熱點[2-5]。

內生菌（Endophyte）是指在生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部，且被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現出外在病癥的真菌或細菌[6]。這些內生菌對宿主植物的生長發育、抗逆性、抗蟲性及抗病性方面均有重要作用，在農業生產、化工制藥、衛生保健等方面有巨大的潛力[6，7]。研究者已在棉花、玉米、甜菜、煙草和黃瓜等多種作物體內分離篩選到具有防病或誘導抗病的內生真菌和細菌[6-10]，但關于板栗栗實內生細菌資源的研究鮮見報道。試驗以新培育的耐貯藏南方板栗——羅田板栗新品系玫瑰紅栗實為研究對象，采用組織分離法分離，并利用16S rDNA序列分析和形態、生理生化相結合的方法鑒定其內生細菌，以期為篩選抗栗實腐爛的拮抗細菌及開發生防保鮮劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 板栗果實 板栗品系為玫瑰紅，采摘于湖北省羅田縣勝利鎮，去苞殼后得到栗實。

1.1.2 培養基 LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3 主要試劑 克隆載體pMD18-T購自TAKARA公司；2×Taq mix、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌TOP10菌株為經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室保存；細菌16S rDNA通用引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 栗實處理 將栗實在自來水下流水沖洗后，用75%的乙醇浸泡3 min，再用8%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水清洗5～7次，用無菌吸水紙吸干水分。取清洗最后一遍的無菌水0.2 mL涂布于LB培養基上，37 ℃培養3 d，據此驗證所用消毒方法是否能殺死供試材料表面全部細菌[11]。

1.2.2 內生細菌分離純化 在無菌環境中，用無菌小刀將處理好的栗實切開并去殼，在種仁中心區和邊緣區處切取邊長為2～5 mm的正方體組織塊，置于經消毒滅菌的研缽中，加無菌水適量，研磨，靜置15 min，取研磨后的上清液稀釋成500倍和1 000倍的組織稀釋液，取200 μL涂布于LB培養基上，于37 ℃倒置恒溫培養1～2 d，從LB平板上將具有不同菌落形態特征的內生細菌單菌落挑出，劃線純化培養，獲得的細菌單株進行編號、轉管，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 內生細菌初步鑒定 將分離的內生細菌適當稀釋后接種到LB培養基上，置于36 ℃的溫箱內培養1～2 d，觀察菌株形態和培養性狀，進行革蘭氏染色和生理生化試驗，對照文獻[12]和文獻[13]進行初步鑒定。

1.2.4 內生細菌分子學鑒定 將分離純化的板栗內生細菌進行活化，挑取少量菌體以細菌16S rDNA通用引物27F、1 492R進行菌落PCR擴增，PCR擴增反應體系50 μL，18 μL無菌ddH2O，25 μL 2×Taq mix，1.5 μL Primer1，1.5 μL Primer2，4 μL懸浮菌液；PCR流程：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35次循環；延伸補齊72 ℃ 10 min。擴增產物經過純化后連接到克隆載體pMD18-T上，轉化感受態大腸桿菌TOP10（CaCl2法制備感受態細胞），然后將轉化的大腸桿菌TOP10涂布在加有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂固體培養基上，37 ℃恒溫培養12～18 h；從上述LB平板上隨機挑取5個白色菌落，轉移到含有氨芐青霉素的LB培養基上，37 ℃過夜，將通過PCR重組子驗證的菌落送交上海生工生物工程有限公司雙向測序，測序結果進行BLAST比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），選取同源性高的16S rDNA序列作為參比對象，使用ClustalX進行DNA序列的排序，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法（Neighbour-Joining method）構建系統發育樹，并進行1 000次的自展檢驗（Bootstrap），將ME樹上與之最接近的種類確定為內生菌可能的種類。

2 結果與分析

2.1 栗實內生細菌初步鑒定情況

從羅田板栗玫瑰紅栗實中共分離出2株內生細菌，分別編號為FR1和FR2。其中，細菌FR1菌落圓形、邊緣齊整、表面濕潤，菌落不透明，呈灰白色，菌體桿狀，革蘭氏染色為陰性（圖1A）；能產生精氨酸水解酶（圖1B）；甲基紅反應為陽性（圖1C）；氧化酶試驗陽性（圖1D）；不具有明膠酶，不能水解明膠（圖1E）；能分解葡萄糖，乙酰甲基甲醇反應為陽性，產生紅色化合物（圖1F）；可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，出現緋紅色陽性反應（圖1G），但沒有氮氣放出；能產生苯丙氨酸脫氨酶，加入三氯化鐵試劑后產生綠色化合物（圖1H），初步鑒定FR1為拉恩氏菌屬（Rahnella sp.）。

內生細菌FR2菌落扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶，菌落直徑2～3 mm，菌體呈桿狀、單生，革蘭氏陽性菌（圖2A），產生游離橢圓形芽孢（圖2B），初步鑒定FR2為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

2.2 栗實內生細菌16S rDNA序列分析結果

利用16S rDNA通用引物27F和1 492R從分離得到的2株內生細菌的基因組中擴增出的DNA片段長度為1 000～2 000 bp（圖3），擴增出的PCR產物經純化進行DNA測序，結果表明FR1、FR2的序列長度分別為1 400、1 038 bp。序列提交GenBank數據庫進行BLAST比對，將FR1、FR2菌株的16S rDNA序列與GenBank中的序列進行比較發現，與FR1同源性最高的菌為拉恩氏菌屬，與FR2同源性最高的是芽孢桿菌屬。將FR1、FR2序列與數據庫中同源性較高的幾個菌株進行比較，并用ClustalX進行多序列比對、用MEGA 5.1軟件中的鄰接法構建系統的進化樹（圖4）。結果表明FR1的16S rDNA序列與細菌Rahnella aquatilis KC351183.1的序列同源性高達97%，從系統發育樹可以看出，FR1與Rahnella aquatilis KC351183.1聚為一簇，該結果支持初步鑒定的結果。綜合FR1的形態、生理生化特征和16S rDNA的序列分析結果，將FR1鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）；從系統發育樹可以看出FR2與Bacillus licheniformis EU221362.1聚為一分支，FR2的16S rDNA序列與Bacillus licheniformis EU221362.1的序列同源性高達98%，該結果支持初步鑒定結果，綜合FR2的形態、生理生化特征和16S rDNA的序列分析結果，將FR2鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

3 小結與討論

板栗儲藏過程中發生腐爛是一個復雜的過程，其中，致病菌的侵染是其主要原因。本研究從羅田板栗玫瑰紅中分離到2株菌株，通過生理生化特征初步鑒定為拉恩氏菌屬（Rahnella sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），結合其16S rDNA的序列分析結果，將2株菌株分別鑒定為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

有資料顯示，拉恩氏菌屬屬于腸桿菌科，廣泛分布于水、土壤、植物根際及蝸牛體內，偶爾能在食品、種子和臨床微生物樣本（傷口、腸胃病患者糞便、敗血癥患者體內）中發現；但目前尚未能明確其致病性。有研究認為，某些拉恩氏菌屬菌株具有抑菌性，能夠作為植物病害生防菌[14]。芽孢桿菌屬在自然界分布非常廣，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態優勢種群之一。其中，地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具有應用潛力的菌種之一，在醫藥、飼料加工、農藥等行業取得了較多的研究成果[15，16]。這2株菌株在板栗果實中的具體作用還有待進一步研究。

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