蛇足石杉內生真菌清除DPPH·與抑制乙酰膽堿酯酶活性研究

摘要：為了從蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]中分離出能產生清除DPPH·和抑制乙酰膽堿酯酶活性物質的內生真菌，采用平板分離蛇足石杉內生真菌，搖瓶發酵并測定其發酵液和菌絲體提取物清除DPPH自由基、抑制乙酰膽堿酯酶活性的能力，形態學和ITS-rDNA序列分析法鑒定獲得的部分內生真菌。結果表明，共分離得到94株內生真菌，有31株內生真菌發酵產物顯示出乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中18株具有顯著的抑制活性，

關鍵詞：蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]；DPPH·；乙酰膽堿酯酶；內生真菌

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0888-06

Effects of Endophytic Fungi Isolated from Huperzia serrata on Scavening DPPH· and AchE Inhibitory

DONG Li-hui1，FAN San-wei1，LING Qing-zhi1，QIAN Hai-feng1，WEI Zhao-jun2

（1.Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 315100，Zhejiang，China；

2.School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei Universuity of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： The endophytic fungi isolated from Huperzia serrate by plate were fermented and identified by morphological characters and ITS-rDNA sequence. The effects of the extracts from fermented broth and mycelium on DPPH· scavenging ratio and inhibition ratio for AchE were investigated. The results showed that 94 endophytic fungis were isolated from Huperzia serrate 31 strains of them exhibited inhibition activity to AChE， while 18 strains isolated from stem（9）， leave（8） and root（1） had significan inhibition rate ranged from 50.3% to 82.78%. The fermentation of 5 strains such as S22， S29， L44， S79 and S94 had both activity of AchE-inhibitory and antioxidant. Through ITS-rDNA sequence analysis the five strains were identified as Arthrinium sp.， Podospora sp， Trichoderma sp.， Colletotrichum sp. and Colletotrichum sp.， respectively. It is indicated that there are endophytic fungi with antioxidant and AchE inhibitory activity in Huperzia serrate.

Key words： Huperzia serrate； DPPH·； AChE； endophytic fungi

蛇足石杉[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]屬于石杉科（Huperiaceae）石杉屬（Huperzia Bernh.）的蕨類植物，近年的研究[1-5]表明，蛇足石杉的主要藥效成分——石杉堿甲（Huperzine A）是一種強效的乙酰膽堿酯酶（Actylcholinesterase，AchE）抑制劑，用于治療重癥肌無力，能改善老年性記憶功能減退，與其他同類產品相比，副作用小[6]，是目前臨床上用于治療老年性癡呆癥（Alzheimers disease，AD）的最有效的藥物。研究表明，石杉堿甲能夠保護神經元細胞對抗β-淀粉樣蛋白產生的毒性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）的產生[7，8]。據研究報道，石杉堿甲能通過刺激超氧化物歧化酶（SOD）的產生而加快氧自由基的清除，減少自由基損傷，保護細胞免受損傷，從而起到治療老年性癡呆的作用[9]。因乙酰膽堿酯酶抑制劑和抗氧化劑均有治療老年性癡呆癥的作用，所以篩選過程中可以將具有抑制乙酰膽堿酯酶活性和抗氧化功能作為篩選的依據。

由于野生的蛇足石杉生長非常緩慢，其資源稀少，并且全草中的石杉堿甲含量僅在0.006%～0.012%，石杉堿甲的人工合成品尚無臨床活性，目前石杉堿甲的來源完全依賴野生資源，所以尋找新的石杉堿甲的來源尤為迫切。近年來，國內的學者從石杉科植物中分離篩選出數株產石杉堿甲的內生真菌[10-12]。從內生真菌的分離研究結果發現，蛇足石杉的內生真菌的種類繁多，內生菌的數量也非常大，這使篩選目標菌株的工作量非常大，目標菌株的命中率低。

本試驗對蛇足石杉植株莖、葉、根內生真菌進行了分離、純化與鑒定，在前期研究的基礎上，以具有抑制乙酰膽堿酯酶活性和清除DPPH自由基活性為雙重篩選目標，對分離得到的內生真菌進行篩選，取得了可喜的結果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為采自浙江天目山脈的藥用植物蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.） Trev.]。

1.2 儀器與試劑

Multiskan Spectrum型多功能酶標儀（美國Thermo Labsystems公司）；XSP-C型生物電子顯微鏡（上海上光新光學科技有限公司）；電泳儀及電泳槽（美國Bio-Rad公司）；PCR反應擴增儀（加拿大BBI公司）；3730測序分析儀（美國ABI公司）。

碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATCI）、5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸（Dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB）、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）均為Sigma公司產品；無水乙醇等試劑均為國產分析純；ITS-rDNA引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 方法

2 結果與分析

2.1 內生真菌種類及其在蛇足石杉體內的分布

從蛇足石杉中共分離到94株不同內生真菌，這些內生菌在植株中分布結果詳見表1。其中莖中所含內生真菌最多，為49株，占總菌株數的52.13%；其次為葉片的38株，占40.43%；根內最少，僅7株，占7.45%。

在對蛇足石杉植株進行內生真菌分離過程中發現，莖和葉的內生真菌要比根豐富，從根部分離到的內生真菌數量較少，僅7株，占7.45%。可見內生真菌在植物組織具有不同的生理分布，另一方面可能是根和葉片對消毒劑更加敏感，因此在消毒過程中，應該根據不同的組織材料選擇最佳的消毒時間。

對分離獲得的94個內生真菌，根據其菌落大小、形態、顏色以及菌絲和孢子的顯微特征，可將其歸屬為Penicillium sp.、Cladosporium sp.、Colletotrichum sp.、Acremonium sp.、 Mortierella sp.、 Paraconiothyrium sp.、 Leptosphaeria sp.、 Shiraia sp.、 Arthrinium sp.、Podospora sp.等12個屬，其中Penicillium sp.，Colletotrichum sp.、Podospora sp.為優勢類群，占總菌數的22.34%、14.89%、14.89%。其中莖部分離到的49株菌分布在這12個屬中的10個屬，并且在Penicillium sp.中占有很大的比重，葉中分離到的38株菌也分布在10個屬中，并且在Podospora sp.中占有最大的數目，根分離到內生真菌7株涉及5個屬（表1）。結果顯示蛇足石杉的內生真菌有豐富的物種多樣性。

2.2 內生真菌菌絲體提取物和發酵液提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性

參考文獻：

[1] 蔣亞斌，黃舜韶，黃立安. 石杉堿甲對阿爾茨海默病患者認知功能和行為障礙的改善作用[J].中國綜合臨床，2002，18（9）：802-803.

[2] 苗秀潤.內服石杉堿甲配合能力訓練對阿爾茨海默病的康復作用[J].中國臨床康復，2002，6（17）：2551.

[3] 常蜀英，陳世銘.石杉堿甲改善中老年語詞記憶障礙的臨床研究[J].醫藥導報，2002，21（5）：263-265.

[4] 王洪新，王 鍵. 石杉堿甲的研究進展[J].中國野生植物資源，2001，20（6）：4-10.

[5] WANG R，YAN H，TANG X C. Progress in studies of huperzine A，a naturalcholinesterase inhibitor from Chinese herbal medicine[J]. Acta Pharmacol Sin，2006，27（1）：1-26.

[6] 宮 斌.老年癡呆癥的基礎和臨床研究進展[J].中國藥學雜志，1997，32（11）：714-717.

[7] LLEO A， GREENBERG S M，GROWDON J H. Current pharmacotherapy for alzheimer’s disease[J]. Annual Review of Medicine，2006，57：513-533.

[8] WANG R，XIAO X Q，TANG X C. Huperzine A attenuates hydrogen peroxide-induced apoptosis by regulating expression of apoptosis-related genes in rat PC12 cells[J]. Neuro Report，2001，12（12）：2629-2634.

[9] 周永其，鄧湘平，顧振綸.石杉堿甲對氧自由基的影響[J].中國野生植物資源，2004，23（2）：254-256.

[10] 黎萬奎，周吉燕，林子為，等.蛇足石杉內生真菌2F09P03B產石杉堿甲發酵條件的研究[J].中國醫藥生物技術，2007，2（4）：254-259.

[11] 周樹良，楊 帆，蘭時樂，等.千層塔內生真菌SHB發酵產石杉堿甲條件的研究[J].微生物學雜志，2009，29（3）：32-36.

[12] 鞠 鏨，王 峻，潘勝利.4種石杉科植物中產生石杉堿甲的內生真菌的分離及初步鑒定和HPLC測定石杉堿甲的含量[J].復旦學報（醫學版），2009，23（4）：445-449.

[13] 李治瀅，楊麗源，周 斌，等.燈盞辛內生真菌的研究Ⅰ： 菌種分離及其分類鑒定[J].云南大學學報（自然科學版），2003，25（1）：65-68.

[14] LIU C H，ZOU W X，LU H，et al. Antifungal activity of Artemisia annua endophytecultures against phytopathogenic fungi[J]. Journal of Biotechnology，2001（88）：277-282.

[15] 張中義，冷懷瓊，張志銘. 植物病原真菌學[M].成都：四川科學技術出版社，1998.

[16] 承 曦，陳 鈞，朱大元，等.蛇足石杉內生真菌g5的乙酰膽堿酯酶抑制活性初步研究[J].微生物學通報，2008，35（11）：1764-1768.

[17] 文 鏡，賀素華，楊育穎，等.保健食品清除自由基作用的體外測定方法和原理[J].食品科學，2004，25（11）：190-194.

[18] 任俊鳳，任婷婷，朱蓓薇.河豚魚皮膠原蛋白肽的提取及抗氧化活性的研究[J].中國食品學報，2009，9（1）：77-83.

[19] 宋大新，范長勝，徐德強，等.微生物學實驗技術教程[M].上海：復旦大學出版社，1992.

[20] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1979.

[21] GUO L D. Advances on researches on endophytic fungi[J]. Mycosystema，2001，20（1）： 148-152.

[22] CHEN Y J，ZHANG Z，WANG Y，et al. Screening endophytic fungus to produce taxol from Taxus yannanensis[J]. Biotechnology，2003，13（2）：10-11.

[23] ZHANG L Q，GUO B，LI H Y，et al. Preliminary study on the isolation of endophytic fungus of Catharanthus roseus and its fermentation to produce products of therapeutic value[J]. Chin Tradit Herb Drugs，2000，31（11）：805-807.

[24] LI H Y，WANG Z J，ZHANG L Q，et al. Isolation of an endophytic fungus associated with Sinopodophyllum emodi[J].J Yunnan Univ-Nat Sci，1999，21（3）：243-245.

[25] ZHANG L Q，GU S，SHAO H，et al. Isolation，determinationand aroma product characterization of fungus producing irone[J].Mycosystema，1999，18（1）：49-54.

[26] LI Y L，HE X C，BAI D L. Studies on analogues of huperzine A for treatment of senile dementia. Ⅳ. synthesis of（±）-8，15-dihydrode-11，15-dimethyl-8-hydroxyl-huperzine A[J].Chin J Med Chem，1996，6（3）：157-191.

[27] 楊曉軍，郭海清，高 霞，等.內生真菌YD-01次生代謝產物的研究Ⅰ[J].中國藥科大學學報，2006，37（5）：479-480.

[28] ZHU D，WANG J，ZENG Q，et al. A novel endophytic huperzine A producing fungus， Shiraia sp. Slf14， isolated from Huperzia serrate[J]. J Appl Microbiol，2010，109（4）：1469-1478.