羊乳中牛乳成分快速檢測(cè)方法的建立

摘要 [目的]建立一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)羊原乳中牛原乳成分的方法。[方法]以牛IgG為檢測(cè)對(duì)象，建立了檢測(cè)羊乳中牛乳成分的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法。[結(jié)果]試驗(yàn)建立的方法可以檢測(cè)出含有2%牛原乳的羊原乳，受基質(zhì)干擾較小。[結(jié)論]該方法具有簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，可以用于羊原乳中牛原乳成分的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 羊原乳;牛原乳;牛IgG;競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法

中圖分類(lèi)號(hào) S879.1 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11496-02

Use of Competitive Immunochromatographic Method for the Detection of Adulteration of Goats’ Milk

ZHAO Fang1，ZHANG Huan2* "（1.Shenzhen EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)ood Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen，Guangdong 518067; 2.Fushun City Product Quality Supervision and Inspection，F(xiàn)ushun，Liaoning 113006）

Abstract "[Objective] Bovine IgG was used as detection protein and a i mmune chromatography assay was established for the detection of adulteration of goats’ milk.[Method] A lateralflow （LF） device was applied to detect bovine IgG in the goats’ milk.[Result] The detection limits of the method was 2% cows’ milk adulteration of goat.[Conclusion] The lateralflow （LF） device performance makes it suitable for development as a kit for use in routine surveillance of milk.

Key words "Goat milk; Cow milk; Bovine IgG; Lateralflow （LF） device

近年來(lái)，羊乳以營(yíng)養(yǎng)豐富、易于吸收、不易導(dǎo)致過(guò)敏等優(yōu)點(diǎn)得到消費(fèi)者的廣泛認(rèn)可，成為我國(guó)乳制品消費(fèi)市場(chǎng)中增長(zhǎng)速度最快的產(chǎn)品。最近10年我國(guó)羊乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，涌現(xiàn)出陜西、山東、河南等奶山羊養(yǎng)殖大省和一批羊乳加工龍頭企業(yè)，羊乳業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)乳業(yè)的重要組成部分。2009年，我國(guó)羊乳產(chǎn)量121.79萬(wàn)t，占奶類(lèi)總產(chǎn)量的3.3%。

羊乳制品主要銷(xiāo)往長(zhǎng)三角、珠三角等地區(qū)，年產(chǎn)值數(shù)十億元。由于羊乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且量少，其市場(chǎng)零售價(jià)是牛乳的1.5～2.0倍。企業(yè)收購(gòu)羊乳的價(jià)格比牛乳高約20%。因而，羊乳摻假現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。常見(jiàn)的羊乳摻假方式有摻水、摻牛乳、摻蔗糖、摻淀粉、摻米湯、摻硫氰酸鹽、摻豆?jié){、摻水解動(dòng)物蛋白等。由于我國(guó)奶羊的飼養(yǎng)多采用 “公司+基地+農(nóng)戶(hù)”的經(jīng)營(yíng)模式，使得羊乳摻假現(xiàn)象更為嚴(yán)重，因而有必要采取各種有效的手段打擊羊乳摻假現(xiàn)象，維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。

免疫學(xué)檢測(cè)以其高特異性、高靈敏性、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)勢(shì)已成為一種重要的快速檢測(cè)方法。筆者針對(duì)羊乳中摻入牛乳成分這一問(wèn)題建立了一種快速簡(jiǎn)便的免疫層析檢測(cè)方法，為羊乳產(chǎn)品的生產(chǎn)銷(xiāo)售提供一種行之有效的質(zhì)控方法。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗牛IgG、牛IgG，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖、檸檬酸鈉、碳酸鉀，購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司;Tween20、NaCl、Tris、NaOH，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;氯金酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。PVC（聚氯乙烯）底板、8964玻璃纖維膜、吸水紙、硝酸纖維素膜（Sartorius 95），購(gòu)自上海捷寧生物科技有限公司。1份山羊奶采集自陜西渭南農(nóng)戶(hù)，1份綿陽(yáng)奶采集自陜西渭南某農(nóng)戶(hù)，1份牛奶（荷斯坦奶牛）采集自遼寧錦州某奶牛場(chǎng)，1份超高溫滅菌乳購(gòu)自撫順某超市。豆?jié){自制：取100 g黃豆，加1 000 ml水，用九陽(yáng)植物奶牛豆?jié){機(jī)磨成豆?jié){，用紗網(wǎng)濾除豆渣，備用。

1.2 方法

1.2.1 納米金顆粒的制備[1]。將100 ml超純水煮沸，加入1 ml 1% 氯金酸，快速攪拌，加入1 ml 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)快速攪拌30 s，低速攪拌14.5 min，按照3 μl/ml的比例加入0.2 mol/L碳酸鉀，混勻，備用。

1.2.2 金標(biāo)記牛IgG。取10 ml膠體金顆粒，加入30 μl 0.2 mol/L碳酸鉀，渦旋混勻;加入10 μg牛IgG，渦旋混勻，室溫靜置15 min;加入1 ml 10% BSA，渦旋混勻，室溫靜置15 min;10 000 r/min離心10 min;加入5 ml 復(fù)溶液[20 mmol/L Tris（pH 7.0），0.5%BSA，5%蔗糖]，重懸顆粒，備用。

1.2.3 結(jié)合墊的制備。將6 mm寬8964玻璃纖維膜浸入處理液[100 mmol/L Tris （pH 7.0），1%蔗糖，1%BSA，0.5% Tween20]，取出，置于室溫干燥過(guò)夜，備用;將處理過(guò)的8964玻璃纖維膜浸入金標(biāo)記兔抗牛IgG液體中，取出，37 ℃過(guò)夜晾干，兩端各剪掉1 cm，備用。

1.2.4 樣品墊的制備。將10 mm寬8964玻璃纖維膜浸入處理液[100 mmol/L Tris （pH 7.0），1%蔗糖，1%BSA，0.5% Tween20]，取出，置于室溫干燥過(guò)夜，備用。

1.2.5 硝酸纖維素膜。T線(xiàn)：用包被液[50 mmol/L Tris（pH 7.5），3%蔗糖]將兔抗牛IgG稀釋至2 mg/ml，按照1 μl/cm噴膜，37 ℃干燥3 d，備用。C線(xiàn)：將SPA稀釋至0.2 mg/ml，按照1 μl/cm噴膜，室溫干燥過(guò)夜，備用。

1.2.6 試紙條組裝。將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次搭接粘貼在PVC底板上，裁成3.5 mm寬的試紙條，2～8 ℃干燥保存。

1.2.7 檢測(cè)樣品。將樣品用50 mmol/L NaCl稀釋1倍。將試紙條平放于臺(tái)面上，取50 μl稀釋過(guò)的樣品于樣品墊上，3～10 min觀察結(jié)果，T、C線(xiàn)均為紅色時(shí)為含牛乳成分奶，只有C線(xiàn)顯色時(shí)樣品中不含牛乳成分或者含有低于此方法檢測(cè)下限的牛乳成分，T、C線(xiàn)均為不顯色或者C線(xiàn)不顯色時(shí)結(jié)果無(wú)效。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)下限 向山羊奶中添加牛奶，使牛奶含量分別達(dá)到0、1%、2%、5%、10%、20%、40%、80%、100%，用所制備的試紙條檢測(cè)上述樣品，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次。由表1可知，當(dāng)牛奶含量達(dá)到2%時(shí)即可被穩(wěn)定檢測(cè)出。

表1 試紙條檢測(cè)羊乳中牛乳檢測(cè)下限分析

牛奶含量

%檢測(cè)結(jié)果（陽(yáng)

性/檢測(cè)數(shù)）牛奶含量

%檢測(cè)結(jié)果

（陽(yáng)性/檢測(cè)數(shù)）

00/5205/5

13/5405/5

25/5805/5

55/51005/5

105/5

2.2 基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 分別向山羊奶中添加綿陽(yáng)奶、豆?jié){，使之含量分別達(dá)到0、0.75%、1.50%、3.10%、6.25%、12.50%、25.00%、50.00%、100%，用所制備的試紙條檢測(cè)上述樣品，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。檢測(cè)結(jié)果顯示，添加綿陽(yáng)奶并不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，而添加豆?jié){到1.50%即可出現(xiàn)假陽(yáng)性。

表2 基質(zhì)對(duì)免疫層析檢測(cè)的影響

含量∥%綿陽(yáng)奶（陽(yáng)性/檢測(cè)數(shù)）豆?jié){（陽(yáng)性/檢測(cè)數(shù)）

00/50/5

0.750/50/5

1.500/53/5

3.100/53/5

6.250/54/5

12.500/55/5

25.000/53/5

50.000/55/5

1000/55/5

2.3 蛋白質(zhì)變性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 分別往羊奶中添加煮沸的牛奶、超高溫滅菌乳，使其含量分別達(dá)到0、0.75%、1.50%、3.10%、6.25%、12.50%、25.00%、50.00%、100%，采用該研究研制的試紙條對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性（詳細(xì)見(jiàn)表3）。

3 討論

向羊乳中摻水、摻牛乳、摻蔗糖、摻淀粉、摻米湯、摻硫氰酸鹽、摻豆?jié){、摻水解動(dòng)物蛋白等嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。目前，已有多種方法檢測(cè)這一損害消費(fèi)者利益的現(xiàn)象。主要有電泳分析[2-3]、色譜分析[4]、分子生物學(xué)分析[5]、免疫學(xué)分析[6-7]等。其中，免疫學(xué)方法以其簡(jiǎn)便、快捷、檢測(cè)成本低等

表3 蛋白質(zhì)變性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

含量∥%煮沸牛奶（陽(yáng)性/檢測(cè)數(shù)）超高溫滅菌乳（陽(yáng)性/檢測(cè)數(shù)）

00/50/5

0.750/50/5

1.500/50/5

3.100/50/5

6.250/50/5

12.500/50/5

25.000/50/5

50.000/50/5

1000/50/5

優(yōu)勢(shì)成為一種重要的檢測(cè)方法。目前，針對(duì)羊乳摻雜牛乳的免疫學(xué)方法主要是針對(duì)牛乳中特定蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，如：牛乳清蛋白[6]、β酪蛋白[8]、γ酪蛋白[9]、牛IgG[10-11]等。該研究以牛乳中IgG為檢測(cè)對(duì)象，建立了快速檢測(cè)羊乳摻雜牛乳的競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)檢測(cè)方法。該方法具有合適的檢測(cè)下限，既可避免在羊乳生產(chǎn)過(guò)程中因容器具受牛源成分污染而引起假陽(yáng)性，又可檢測(cè)出人為添加牛乳到羊乳問(wèn)題，而且具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力（除豆?jié){會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)外），適用于羊原乳中牛原乳成分的快速檢測(cè)。

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