雙孢菇深層發酵培養條件的優化研究

摘要 [目的]研究了雙孢菇搖瓶孵育時不同氮源及碳氮比的優化配比以及雙孢菇的成長優化條件，為野生菌種質資源保存和馴化提供借鑒之法。[方法]采用7種有機氮源、4種無機氮源，構成8個碳氮比梯度，研究菌球直徑、菌球密度、菌絲生長量等生物量指標，考察雙孢菇搖瓶孵育條件、氮代謝特性。[結果]通過正交設計試驗，分別優化了雙孢菇液體發酵培養的碳氮源最佳組合以及無機鹽的最佳組合，得到了雙孢菇液體發酵的適宜培養基：葡萄糖3% 、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5% 、KH2 PO4 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%， pH5.5，溫度35 ℃。采用優選氮源、濃度梯度，顯著或極顯著改觀雙孢菇成長。黃豆、黃豆芽是雙孢菇斜面培養基的良好氮源，菌球密度分別達到27.64%和25.00%，是對照的162%和142%。其次是蛋白胨、酵母膏差異顯著，而甘氨酸與硫酸銨、硝酸鉀做氮源之間差異不顯著，尿素是最差的氮源。3.1%黃豆芽和黃豆均可產生最大雙孢菇生物量，可取代蛋白胨、酵母膏的有機氮源。適宜雙孢菇生長的碳氮比為35∶1。[結論]雙孢菇培養時存在氮源的選擇性差異，有機氮源優于其他氮源，同時氮源梯度極顯著影響斜面種產量。

關鍵詞 雙孢菇;斜面培養;氮源;碳氮比

中圖分類號 S646 "文獻標識碼

A "文章編號 0517-6611（2014）32-11247-03

Study on Optimization of Culture Condition of Agaricus bisporus Submerged Fermentation

WANG Li1， WANG Feng2， WU Xing3 "（1. Inspection College of Ningxia Medical University， Yingchuan，Ningxia 750004; 2. Wuzhong People Hospital， Wuzhong， Ningxia 750004;3.Yanchi County of Ningxia Agricultural Extension Service Center，Yanchi，Ningxia 751500）

Abstract "[Objective] With Agaricus bisporus flask incubation， the proportion of different nitrogen sources and carbon nitrogen ratio was optimized， and the optimum conditions for the growth of Agaricus bisporus was studied， so as to provide reference for wild mushroom germplasm resources.[Method] 7 kinds of organic nitrogen source， 2 kinds of inorganic nitrogen sources and 8 ratio of carbon to nitrogen gradient were adopted. Ball diameter， bacteria density and amount of mycelium biomass，etc were studied to inspect the flask incubation condition and nitrogen metabolic characteristics of Agaricus bisporus. [Result]Through orthogonal design test， the optimum combination of the double spore mushroom liquid fermentation and the best combination of carbon and nitrogen source and inorganic salts were studied， resulting in a suitable medium of Agaricus bisporus liquid fermentation of glucose xylose： glucose 3%， xylose 3%， peptone 0.3%， yellow bean sprouts 5%， KH2 PO4 0.1%， MgSO4·7H2O 0.05%， （NH4）2 SO4 0.2%， pH 5.5， temperature 35 ℃. The optimum nitrogen source and concentration gradient significantly or extreme significantly changed the double spore mushroom growth. Soybean and bean sprouts were good nitrogen sources of Agaricus bisporus slant medium， and pellet density reached 27.64% and 25%， which were 162% and 142% of the control. The second was peptone and yeast extract significantly， while glycine and ammonium sulfate， potassium nitrate had no significant difference between nitrogen source， nitrogen source urea was the worst. 3.1% yellow bean sprouts and soybeans could produce maximum double spore mushroom biomass， but organic nitrogen source could be instead of peptone and yeast extract. Carbon and nitrogen ratio suitable for mushroom growth was 35∶1. [Conclusion] Agaricus bisporus cultivation in nitrogen sources had difference， and the organic nitrogen source was better than the other nitrogen sources， while nitrogen source gradient significantly affected the slope of the yield.

Key words "Agaricus bisporus; Slant cultivation; Nitrogen source; Carbon nitrogen ratio

雙孢菇（Agaricus bisporus），又稱白蘑菇、洋蘑菇，簡稱蘑菇。雙孢菇不僅營養價值高，有“植物肉”的美稱，含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質，而且具有很好的降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎護肝等多種保健價值。雙孢蘑菇是一種單因子次級同宗配合方式進行遺傳的食用真菌。

氮源是食用菌合成細胞壁、核酸和蛋白質等的主要原料。蛋白胨、氨基酸、酵母膏、尿素、豆餅、麥麩、米糠和畜禽等有機氮和氨、銨鹽、硝酸鹽等無機氮可以作為食用菌的氮源，與碳源營養物質構成（19～45）∶1的碳氮比。雙孢菇與其他種類食用菌一樣存在著氮源種類和濃度的選擇性利用。對雙孢菇菌的液體深層發酵培養基組分中的碳源、氮源、無機鹽種類進行選擇性試驗分析，以期獲得最適碳源、氮源、無機鹽及最優配比。酵母膏和蛋白胨是雙孢菇搖瓶深層發酵的最佳氮源，因此開展氮源種類和濃度的優化是雙孢菇雜交育種、提純復壯以及生理生化研究的前提。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。雙孢菇斜面菌種，為寧夏醫科大學公衛學院實驗室保藏菌種。葡萄糖、氯仿、苯酚、硫酸、正丁醇， 均為分析純試劑。

1.1.2 雙孢菇提取物的常規分析。

水分含量測定采用干燥法GB5009.32003;灰分含量測定采用高溫灼燒法GB5009.42003;蛋白質含量測定采用凱氏定氮法GB5009.52003;粗脂肪含量測定采用索氏抽提法GB5009.62003;粗纖維含量測定采用酸性洗滌法;還原糖的測定采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法。

1.2 方法

搖瓶培養法轉速220 r/min，溫度35 ℃，每瓶50 ml培養基?；罨囵B基配制與菌絲體活化以雙孢菇一號品種為試驗材料。Mandels培養基作為營養培養基，培養基在121 ℃條件下滅菌30 min，滅菌后趁熱倒搖瓶培養基，自然冷卻。 " 在超凈工作臺上取少許試管種，每個搖瓶培養瓶接菌種，于25 ℃環境溫度下進行培養，菌絲體快生長滿搖瓶時結束菌絲體活化生長，進入液體培養基試驗階段。不同氮源、碳源和碳氮比見表1。

表1 不同氮源、碳源和碳氮比、收菇時的蛋白質含量

碳氮源碳氮比葡萄糖木糖蛋白質含量∥%

蛋白胨 "42 "45 "42

畜禽3537 36

酵母膏 "37 "40 "40

尿素 20 19 23

豆餅 38 35 39

麥麩 34 31 37

米糠 33 32 26

氨基酸 30 29 29

氨394137

銨鹽 41 40 40

硝酸鹽 "35 "34 "34

2 結果與分析

2.1 雙孢菇提取物常規分析結果

雙孢菇提取物（質量分數）中，水分7.91%，灰分16.14%，蛋白質42%，粗脂肪0.16%，粗纖維0.06%，碳水化合物33.73%。葡萄糖標準曲線回歸方程為：Y=4.927X+0.035 9。經計算，粗提物中多糖質量分數為39.6%。

2.2 不同氮源影響雙孢菇液體種的生長

優化比較

7種有機氮源和4種無機氮源。經方差分析，發現黃豆、黃豆芽培養基菌球直徑與其他培養基之間存在0.01水平顯著性差異，是最好的氮源供給種類，黃豆、黃豆芽培養基菌球密度分別達到27.64%和25.00%;其次是蛋白胨、酵母膏，二者之間差異不顯著：尿素是最差的氮源，比供試無機氮源還差，甘氨酸與無機氮源的硫酸銨、硝酸鉀之間差異不顯著，而無機氮源中銨態氮的選擇利用效果優于硝態氮。當以黃豆芽為氮源時新生菌絲體生長量最高達12 kg/m2，而銨鹽、酵母膏、蛋白胨次之，以尿素作為氮源時菌絲的生長量最低，僅有3 kg/m2。總體而言，對有機氮的利用基本好于無機氮，對尿素則幾乎不利用。

2.3 氮源梯度影響雙孢菇液體種的生長

試驗設計的碳氮培養基都有利于液體種生長。例如，黃豆、黃豆芽培養基生產的菌絲球個數分別是以蛋白胨為氮源的常規培養基配方下菌絲球個數的2、4倍。種植黃豆的培養基是可以取代蛋白胨作為有機氮源培育雙孢菇液體種。

圖1 優化雙孢菇生長條件的實驗場景

2.4 "碳氮比影響雙孢菇液體種的生長 優化雙孢菇生長條件的實驗場景見圖1。通過不同碳氮比配方試驗研究，發現蛋白胨、酵母膏配方都顯著或極顯著優于其他處理，雙孢菇菌球直徑、菌球密度、菌絲球個數、接種塊上新生菌絲長度均達到最大值，分別為26 cm、27.64%和25.00%、60個/cm2、30 cm。當菌絲體增加，收菇時，雙孢菇菌球密度、菌絲球個數、菌絲長度分別是27.64%和25.00%、60個/cm2和35 cm。綜合各項指標，適宜雙孢菇生長的碳氮比是35∶1。

2.5 最佳發酵條件的確定

選擇L9 （33）進行正交試驗優化發酵條件（表2、3）。由表2可知，三因素對菌絲體多糖含量的影響順序為碳源gt;氮源gt;pH 。菌絲體多糖積累的最佳培養基為： 葡萄糖3%、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5% 、KH2 PO4 "0.1% 、MgSO4.7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%，pH 5.5，溫度35 ℃。

表2 正交試驗因素水平

水平葡萄糖+黃豆芽∥%木糖+酵母膏∥%pH

11+20.2+55.5

22+20.4+56.5

33+20.6+57.0

表3 正交試驗結果及極差分析

試驗號因素ABC多糖含量

g/L

11116.30

21226.90

31337.20

42125.30

52238.90

62318.40

731311.53

832112.65

933213.46

K123.0019.3425.37

K220.0027.5425.69

K335.4329.6126.89

R16.8315.344.37

3 結論與討論

通過雙孢菇液體種對7種有機氮源和4種無機氮源的優化選擇利用研究，發現雙孢菇液體對有機氮源中的黃豆、黃豆芽、酵母膏、蛋白胨物質的利用優于無機氮源中硫酸銨、硝酸鉀，天然氮源營養物質黃豆和黃豆芽可以完全替代酵母膏和蛋白胨，對有機氮源中的尿素的利用效果最差。在通常情況下，食藥用菌液體深層培養的最佳氮源為酵母膏、豆餅粉，蛋白胨次之。在雙孢菇深層培養中，酵母膏和蛋白胨是首選有機氮源，其次是鉬酸銨、草酸銨、硫酸銨和硝酸銨，而硝酸鉀和尿素不作為培養該菌的氮源使用。

氮源種類、碳氮比優化對雙孢菇液體種生長的效應研究表明，雙孢菇對不同氮源物質的代謝能力有所不同[1-5]。通過正交設計試驗，分別優化了雙孢菇液體發酵培養的碳氮源最佳組合以及無機鹽的最佳組合，從而得到雙孢菇液體發酵的適宜培養基：葡萄糖3%、木糖3%、蛋白胨0.3%、黃豆芽5%、KH2 PO4 0.1%、MgSO4.7H2O 0.05%、（NH4）2 SO4 0.2%，pH "5.5，溫度35 ℃。

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