雜種落葉松愈傷組織誘導培養基的建立和優化

摘要

[目的] 建立一種高效穩定的雜種落葉松組織培養體系。[方法]以雜種落葉松成熟合子胚作為外植體材料，對其按照不同處理方式進行消毒，且以不同種類培養基和激素種類及濃度進行愈傷組織的誘導，測算愈傷組織的體積。[結果]將去皮種子用流水沖洗2 d，用70%乙醇消毒1 min轉入4%NaClO消毒15 min后，再將剝出的胚放入0.5%NaClO消毒2 min胚存活率最高;在光照條件下，BM培養基中添加2.0 mg/L TDZ愈傷組織的誘導效果最好，愈傷組織的誘導率為90.5%;愈傷組織的L、W、H與t呈類線性關系，體積與時間呈類指數關系。[結論] 為落葉松穩定組織培養體系的構建和優化提供方法。

關鍵詞 "雜種落葉松; 成熟合子胚; 愈傷組織誘導; 愈傷組織體積

中圖分類號 S188 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11243-04

The Culture Medium Establishment and Optimization for Callus Induction of Hybrid larch

ZHANG Li，ZHANG Lei*， FANG Jiaoyang et al

（Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract "[Objective] The aim was to establish a highly efficient and stable tissue culture system of Hybrid larch.[Method]Using mature zygotic embryos of Hybrid larch as explants material， different treatments for disinfection， and Callus induction were done in types "of different medium and hormone ， and the volume of callus was measured. [Result]Statistical analysis results showed that： the peeled seed washed with water for 2448 h， 70% alcohol disinfection for 1min into 4%NaClO for 15 min and then stripping out the embryo into 0.5% NaClO disinfection "for 2 min， survival rate of embryo was highest. ; In the light conditions， induced effect of cultured callus medium was best in BM by adding 2 mg/L TDZ， induction rate of the callus was 90.5%; callus long， width， thickness and time were linear relationship， was the exponential relationship between volume and time. [Conclusion] The study provided method for construction and optimization of "stability and tissue culture system of Hybrid larch.

Key words "Hybrid larch;Mature zygotic embryos;Callus induction;Volume of callus

落葉松是我國東北地區主要的針葉用材樹種，在林業生產中占有重要地位[1]，具有分布面積廣、適應性強、生長迅速、耐寒能力強等特點。雜種落葉松（Hybrid larch）是落葉松屬中一個非常重要的速生樹種，其遺傳增益大，具有樹干通直、圓滿，木材堅硬、耐腐蝕等特點，是鐵路、橋梁、造船、電業等方面的優良用材[2]。但由于落葉松生長周期長，采用常規育種進行新品種選育時，耗時長、見效慢，且某些優良性狀在繁殖過程中無法控制，子代遺傳的效果差，同時還存在基因資源缺乏和雜交不親和等制約因素，落葉松組織培養不可控因素較多，且不同種落葉松無性繁殖差異性較大，所以需要建立一種高效穩定的組織培養體系，而其中愈傷組織的誘導是組織培養過程的第一步，也是比較重要的一步，通過穩定的愈傷組織誘導培養基的建立和優化，可以為落葉松穩定組織培養體系的構建和優化提供方法，也為無性系的繁殖、落葉松遺傳改良及轉基因育種奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2013年采自黑龍江省牡丹江市林口縣青山種子園的成熟種子。

1.2 試驗方法

1.2.1

外植體的消毒。選擇成熟、飽滿的雜種落葉松種子，剝去種皮后，流水沖洗24～48 h。先使用70%的乙醇消毒1 min后，分別在4%NaClO消毒10、15、20 min，30% H2O2消毒15、20、30 min，或者0.1% HgCl2消毒6、8、10 min（HgCl2消毒時間過長時將胚殺死），然后無菌水洗凈，剝去胚乳，將胚用0.5% NaClO消毒2 "min，無菌水洗凈并用滅菌濾紙吸干水分，接種到培養基上，7 d后統計存活率（即非感染菌）。

1.2.2

基本培養基及激素組合、濃度的篩選。

以MS、S和BM為基本培養基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L ，肌醇1 g/L ，L谷氨酰胺（LGln）450 mg/L，水解酪蛋白（CH） 500 mg/L，調節pH為5.8～6.0，MS、S置暗培養，BM光培養（暗培養效果差），按設計的激素組合及濃度（表2）分別添加至基本培養基中，置于23～25 ℃培養，觀察愈傷組織形態及生長狀況并統計愈傷率。

1.2.3

愈傷組織的長、寬、厚的測量及體積的計算。

在BM培養基，TDZ 2.0 mg/L的條件下，統計L、W、H。將接種日期記為第1天，每隔7 d用游標卡尺測量L、W、H，測12次，計算體積（mm3）。其中，1～ 3次按長方體計算體積V長，4～7次按圓錐體計算V錐，8～12次按球體計算V球，并對所得數據進行統計分析。V的計算公式如下：

V長=L*W*H

V錐=（1/48）*3.14* L*（W+H）2

V球=（1/162）*3.14*（L+W+H）3

1.3 數據統計及分析

數據統計時以試驗中每一培養皿作基本單元分別統計，然后按處理方式的不同進行分類，求得平均值、標準差等，根據數據的情況進行方差分析、多重比較、時序分析等。

2 "結果與分析

2.1 不同消毒處理的分析

NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒時間對胚存活率的影響見表1。由表1可知，9種不同處理方式中，以NaClO（4%）消毒15 min及HgCl2（0.1%）消毒10 min為佳，未染菌胚的存活率分別為88.9%和83.6%，標準差s分別為0.130 5和0.320 2。由于HgCl2的毒性較強并易污染環境，因此9種處理方式中以NaClO（4%）消毒15 min最佳。按滅菌劑的種類不同，得到的存活率依次為68.0%、49.0%和48.1%，標準差s依次為0.241 7、0.250 7和0.380 1。由此可知，NaClO的消毒效果顯著優于H2O2和HgCl2。

表1 NaClO、H2O2、HgCl2不同消毒時間對胚存活率的影響

滅菌劑

種類濃度

%處理時

間∥min外植體

總數∥個胚存活

數∥個胚存活

率∥%胚整體存

活率∥%

NaClO410563562.4 abc68.0 a

15807088.9 a

20643148.5 cd

H2O23015724359.3 bc49.0 b

20482859.0 bcd

30702231.4 de

HgCl20.1660813.3 e48.1 b

8643250.0 cd

10564783.6 ab

注：多重比較采用Duncan法，同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

表2 培養基和激素組合對愈傷組織誘導的影響

培養基激素組合及

濃度∥mg/L愈傷率

%愈傷組織的生長情況

MS0.5a+0.05b23.5白色，緊實，含水量大，生長慢

0.5a+0.5b31.4白色，緊實，生長較慢

0.5a+1.0b42.7白色、乳白色，疏松，生長一般

1.0a+0.05b44.3白色、乳白色，疏松，生長一般

1.0a+0.5b47.6黃白色、黃綠色，疏松，生長快

1.0a+1.0b40.9白色，疏松，生長一般

2.0a+0.05b48.1黃白色、黃綠色，疏松，生長快

2.0a+0.5b52.5黃白色、黃綠色，疏松，生長較快

2.0a+1.0b59.8黃白色、黃綠色，疏松，生長較快

0.05b+0.5c26.7白色，緊實，含水量大，生長慢

0.5b+0.5c32.8白色，緊實，生長慢

0.05b+1.0c39.5白色，緊實，生長一般

0.5b+1.0c45.2白色、乳白色，疏松，生長快

0.05b+2.0c33.1白色，緊實，生長慢

0.5b+2.0c31.9白色，緊實，生長慢

S0.5a+0.5b+0.5d17.6白色、黃白色，質地硬，致密，生長慢

0.5a+0.5b+1.0d10.3含水量大，后期逐漸褐化死亡

0.5a+1.0b+0.5d15.8白色、黃白色，質地硬，致密，生長慢

0.5a+1.0b+1.0d12.4白色，緊實，生長較慢

1.0a+0.5b+0.5d14.2白色，緊實，生長較慢

1.0a+0.5b+1.0d7.9含水量大，后期逐漸褐化死亡

1.0a+1.0b+0.5d16.8白色、黃白色，質地硬，致密，生長慢

1.0a+1.0b+1.0d9.8含水量大，后期逐漸褐化死亡

2.0a+0.5b+0.5d18.3白色、黃白色，質地硬，致密，生長慢

2.0a+0.5b+1.0d14.4白色，緊實，生長較慢

2.0a+1.0b+0.5d25.7黃白色，緊實，生長慢

2.0a+1.0b+1.0d20.2黃白色，緊實，生長慢

BM0.1b+0.5c40.6黃綠色、淺綠色，緊實，生長慢

1.0b+0.5c42.6淺綠色，致密，生長慢

2.0b+0.5c36.9黃綠色，致密，生長慢

0.1b+1.0c50.2綠色、黃綠色，疏松，生長快

1.0b+1.0c59.4綠色、黃綠色，疏松，生長快

2.0b+1.0c39.8黃綠色，致密，生長慢

0.1b+2.0c45.1淺綠色、黃綠色，致密，生長慢

1.0b+2.0c50.5綠色、黃綠色，疏松，生長快

2.0b+2.0c48.8淺綠色、黃綠色，致密，生長一般

1.0e55.6淺紫紅色、淺綠色，致密，生長一般

1.5e84.2紫紅色、綠色，疏松，生長較快

2.0e90.5紫紅色、綠色，色澤明亮，松散，生長快

2.5e41.1淺紫紅色、淺綠色，致密，生長慢

注：a，b，c，d，e依次代表2，4D，6BA，NAA，KT，TDZ。

2.2 基本培養基及激素組合、濃度對愈傷組織誘導的影響

2.2.1

基本培養基對愈傷組織誘導的影響。

基本培養基對愈傷組織誘導的影響見表2。由表2可知，MS培養基上的愈傷率為23.5%～59.8%，平均為40.0%，愈傷組織大多呈白色，生長速度一般;S培養基上的愈傷率為7.9%～25.7%，平均為15.3%，愈傷組織大多呈白色，生長速度慢，且更易褐化死亡;BM培養基上的愈傷率為36.9%～90.5%，平均為52.7%，愈傷組織呈綠色、黃綠色和紫紅色，生長速度較快。由此可知，BM培養基適合于雜種落葉松成熟胚愈傷組織的誘導，MS培養基次之。

2.2.2

激素組合、濃度對愈傷組織誘導的影響。激素組合、濃度對愈傷組織誘導的影響見表2。由表2可知，MS培養基中主要包括2，4D+6BA與NAA+ 6BA 2種激素組合類型。當2，4D與6BA組合使用時，愈傷率為23.5%～59.8%，平均43.4%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈白色或黃白色，質地疏松，生長速度一般（圖1）;當添加激素為NAA與6BA組合時，愈傷率為26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈白色，緊實，生長速度較慢（圖2）。

S培養基上，2，4D、6BA與KT 3種激素組合使用時，愈傷率為7.9%～25.7%，平均為15.3%，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L KT組合為最佳，愈傷組織呈白色或黃白色，緊實，生長速度慢且一段時間后褐化死亡（圖3）。

BM培養基上有NAA+ 6BA與TDZ單獨使用2個處理。當NAA與6BA組合使用時，愈傷率為36.9%～59.4%，平均46.0%，以1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 6BA組合為最佳，愈傷組織呈綠色、黃綠色，緊實，生長一般（圖4）;當單獨使用TDZ時，愈傷率為44.1%～90.5%，平均67.9%，以2.0 "mg/L TDZ為最佳，愈傷組織呈紫紅色、綠色、黃綠色，疏松或緊實，生長較快（圖5）。

圖1 在MS上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖2 在MS上添加1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖3 在S上添加2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L6BA+0.5 mg/LKT生長的愈傷組織

圖4 在BM上添加1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6BA生長的愈傷組織

圖5 在BM上添加2.0 "mg/L TDZ生長的愈傷組織

2.3 愈傷組織的量化與分析

愈傷組織的L、W、H及V隨時間t變化結果見表3。L、W、H與t基本符合線性正相關，且增長率隨t變化不明顯（圖6）。V與t在43 d之前基本呈線性正相關，且相關系數很小; 43 d后，V與t呈近指數關系，V隨t的增加而增大較快（圖7）。以BM+TDZ 2.0 mg/L上生長的愈傷組織作為統計對象，進行愈傷組織L、W、H及V的時序分析，使得對愈傷組織生長狀況有一個量化的衡量標準。

對V與t進行回歸擬合時，以V與t的立方關系為宜，擬合方程的F值為27.69，P值為0.001，Rsq（adi）值為99.5%，說明方程的擬合效果較好，且經驗證，當t>40時，擬合方程較為準確（圖8），擬合方程：

V=7.44+0.009t-0.101 1t2+0.003 49t3

表3 愈傷組織尺寸隨時間變化

試驗天數

dL均值

mmW均值

mmH均值

mmV均值

mm3

01.720.960.631.06

72.191.310.922.68

142.701.861.306.56

213.673.182.838.99

284.343.493.1112.73

354.924.123.8721.18

426.095.344.5139.51

498.377.056.19198.70

569.738.057.35311.89

6311.609.438.62507.54

7012.8810.349.57686.74

7714.4012.0910.681 002.56

圖6 L，W，H的時間序列圖

圖7 V時間序列圖

圖8 V與t擬合線圖

42卷32期 " " " " " " " "張 莉等 雜種落葉松愈傷組織誘導培養基的建立和優化

3 結論與討論

組織培養過程中，獲得無菌的外植體是植物組織培養取得成功的最基本前提。落葉松成熟種子多帶有內生菌，消毒非常困難，對種子表面消毒不能完全殺死內生菌[3]。該試驗以4%NaClO對去皮種子消毒處理15 min后，洗凈，剝去胚乳再用0.5%次氯酸鈉對胚消毒2 min，洗凈，胚的污染率最低，存活率達到88.9%，與王偉達等[3]研究結果相近，其利用2%NaClO消毒50 min后挑出胚直接接種，污染率高達91.1%，對去皮種子進行消毒后，挑出胚放入0.5% NaClO中進行浸泡，在不降低胚存活率的情況下明顯降低了污染率，胚存活率為78.8%，證明用低質量濃度的NaClO對胚進行浸泡處理的必要性。

愈傷組織誘導的最佳培養基為BM培養基，激素以2.0 mg/L TDZ單獨作用時愈傷組織誘導率最高，為90.5%，愈傷組織呈紫紅色、綠色，疏松或緊實，生長較快，該結論與激素促進作用的倒鐘形曲線相符[4]，這為愈傷組織的分化、不定芽的發生奠定了基礎，在MS培養基上，當2，4D與6BA組合使用時，以2.0 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA組合為最佳，當添加激素為NAA與 6BA組合時，愈傷率為26.7%～45.2%，平均34.9%，其中1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6BA組合為最佳，該結論符合在誘導愈傷組織時，生長素與細胞分裂素組合使用，當生長素濃度高于細胞分裂素濃度時，能提高愈傷率的規律[5];S培養基上，2，4D、6BA與KT 3種激

素組合使用時，愈傷率為7.9%～25.7%，平均

15.3%，表明

S培養基不適合于雜種落葉松成熟胚愈傷組織誘導，這與齊

力旺等[6]對華北落葉松未成熟胚愈傷組織誘導的結果不同;通過統計BM、S、MS 3種基本培養基上愈傷組織的誘導率、觀察愈傷組織生長狀況，表明高鹽濃度的培養基可能促進愈傷組織數量及鮮重增加。

該研究通過對愈傷組織的L、W、H及V的時序分析，得到L、W、H、V與t正相關的結果，通過對線圖的觀察可以了解不同時間段的增長趨勢。V與t的回歸擬合，使得通過t來估算V成為可能，但目前由于跟蹤測量的次數較少使得該擬合方程是否能夠通過t來預測V還有待進一步研究。

影響愈傷組織發生的因素包括基因型、采集時間或者合子胚的發育階段、培養基、植物生長調節物質、碳源的濃度、凝膠物質的濃度、肌醇等。盡管已有很多樹種誘導出愈傷組織，但大多仍顯示出相當低的有效愈傷誘導率，一般在0～10%。因此，誘導出大量的有效愈傷組織，使其保持旺盛的分化狀態，是進行后續以愈傷組織為基礎試驗的重要環節[7]。

該試驗以雜種落葉松成熟合子胚為材料，進行愈傷組織的誘導和增殖，盡管該試驗在誘導、繼代過程中都出現過褐化、死亡現象，但最終還是有部分生長旺盛且具胚性的愈傷組織能夠長期繼代增殖，這為愈傷組織的分化及不定芽的誘導提供了前提。

參考文獻

[1]

孫曉梅，張守攻.日木落葉松紙漿材優良家系多性狀聯合選擇[J].林業科學，2005，41（4）：48-54.

[2] 崔海濤，張玲敏.長白落葉松形態特征與生物學特性[J].現代農業科技，2012（7）：212.

[3] 王偉達，李成浩，張含國，等.長白落葉松愈傷組織誘導與不定芽分化[J].東北林業大學學報，2008，36（2）：6-7.

[4] ROBERTS D R，FLINN B S，WEBB D T，et al.Abscisic acid and indole3butyric acid regulation of maturation and accumulation of storage proteins in somatic embryos of interior spruce[J].Physiologia Plantarum，1990，78：355-360.

[5] KIM Y W，MOON H K.Enhancement of somatic embryogenesis and plant regeneration in Japanese larch[J].Plant Cell.Tissue Organ Culture，2007，88：241-245.

[6] 齊力旺.華北落葉松體細胞胚胎發生與遺傳轉化系統建立的研究[D].北京：中國林業科學院，2000.

[7] 趙曉敏.興安落葉松胚性愈傷組織誘導研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2007.