一株煙堿降解菌的選育及其應(yīng)用研究

摘要

[目的]尋求有效降低煙草中煙堿含量的方法。[方法] 從延安卷煙廠發(fā)酵裝置的廢水中分離純化出1株高效降解煙堿的細菌，并利用該菌制成的粗酶液作用于某等級煙葉，考察其是否可以降低煙堿含量，改善煙葉品質(zhì)。[結(jié)果]利用含有煙堿的選擇培養(yǎng)基共分離純化出71株能夠分解利用煙堿的細菌，其中W9菌分解能力最強，降解試驗表明，該菌在煙堿含量1.4%左右的煙堿水提液里經(jīng)16 h搖床培養(yǎng)，煙堿可被完全降解。將該菌的粗酶液噴施在煙葉上，經(jīng)數(shù)天室內(nèi)發(fā)酵后，評吸結(jié)果表明，刺激性、勁頭明顯降低，抽吸品質(zhì)得到明顯改善。[結(jié)論]研究表明，該菌在降煙堿含量及改善煙葉品質(zhì)方面具有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 煙堿降解菌;粗酶液;煙草發(fā)酵

中圖分類號 S572 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11483-02

Breeding and Application of a Nicotine Degrading Bacteria

LEI Chao1， GUO Dongdong2， ZHAO Jiafu2 et al

（1. Ganquan senior High School， Ganquan， Shaanxi 716100; 2. The Life Science Department of Yan’an University，Yan’an， Shaanxi 716000）

Abstract [Objective] In order to seek a method to reduce the nicotine in tobacco. [Method] A strain of highefficient nicotine degrading bacteria was seperated and purified from wastewater of fermentation device in Yan’an Cigarette Factory， crude enzyme liquid was applied on a certain grade tobacco， whether it can reduce the nicotine content， improve the quality of tobacco leaves was investigated. " " " [Result] in the experiment 71 strains which can degrade and use nicotine have been separated and purificated in use of the choosing medium with nicotine， of which W9 was of relative higher ability of degrading nicotine. The results showed that： The nicotine in the water of extracted nicotine contained 1.4% nicotine can be completely degraded by the strain W9 for 16 hours. The crude enzyme liquid of the bacteria would be sprayed on the tobacco leaves， which would be fermented for a few days in the room. The results from smoking showed that： Irritation and momentum has decreased and the sucking quality has been obviously improved. [Conclusion] Therefore， we can see there is a certain application in descending the nicotine and improving the tobacco quality by the bacteria.

Key words "Nicotine degrading bacteria; Crude enzyme liquid; Tobacco fermentation

煙堿又名尼古丁，是煙草生物堿的主要成分。一般來講，煙堿含量高的煙葉，煙氣勁頭大，反之則少。因此煙氣中含有一定量的煙堿是完全必要的，但煙堿的含量也不能過高，否則會增加煙氣的刺激性，影響卷煙吸味，而且從安全性的角度來講也是一個不利的因素[1]。隨著世界范圍反煙運動的不斷深入和消費者對自身健康和環(huán)保意識的增強，從世界范圍來看，幾乎所有類型的卷煙產(chǎn)品都在向低焦油和低煙堿的淡味型卷煙方向發(fā)展[2]。

利用微生物及其酶降低煙草葉尼古丁的含量是目前卷煙工業(yè)發(fā)展的方向。筆者從延安卷煙廠發(fā)酵裝置的廢水中分離純化出1株高效降解煙堿的細菌，并利用該菌制成的粗酶液作用于某等級煙葉，以降低煙堿含量，改善品質(zhì)，旨在通過這方面的研究工作為利用微生物及其酶降低煙草煙堿含量的工作做一些有益的探索。

1 " "材料與方法

1.1 材料

1.1.1

原料。某特定等級的上部煙葉和煙絲，由延安卷煙廠提供;土樣，采自延安卷煙廠煙葉倉庫;污水樣，采自延安卷煙廠人工發(fā)酵裝置;煙鍋的煙垢樣。

1.1.2

主要試劑。36%～38%鹽酸，分析純，購自西安三浦精細化工廠。

1.1.3

主要設(shè)備儀器。UV1240紫外分光光度儀，HC2518高速離心機，JY96Ⅱ超聲波細胞粉碎機，ZJS1320氣浴式振蕩器，KDC160HR高速冷凍離心機。

1.2 " "方法

1.2.1

培養(yǎng)基的制備。基本培養(yǎng)基： 參照文獻[3];

初篩培養(yǎng)基A：添加煙堿水提液使基本培養(yǎng)基的煙堿初始濃度為0.2%;初篩培養(yǎng)基B：添加煙堿水提液使基本培養(yǎng)基的煙堿初始濃度為0.3%;

發(fā)酵培養(yǎng)基A：添加煙堿水提液使基本培養(yǎng)基的煙堿初始濃度為2.0%左右;

發(fā)酵培養(yǎng)基B：將煙堿水提液稀釋到1.4%左右，pH 7.0～7.5;

保藏培養(yǎng)基：0.5 g牛肉膏，1.0 g蛋白胨，0.5 g NaCl，100 ml水，pH 7.0;種子培養(yǎng)基：參照文獻[3]。

1.2.2

煙堿水提液的制備及煙堿測定。 " " " 稱取一定量特定等級的煙葉或煙絲，加入10倍體積的水中過夜，過濾，取濾液用于培養(yǎng)基的制備，剩下的煙堿水提液0.1 MPa滅菌30 min后備用。煙堿測定：參照文獻[4]進行。

1.2.3

菌種初篩。 " " " 利用稀釋涂平板法[5]對采自延安卷煙廠倉庫的土樣、煙葉和車間的污水樣以及煙鍋的煙垢樣里的微生物進行分離純化，共得到71株細菌。將得到的71株細菌點刺到初篩培養(yǎng)基B上，30 ℃培養(yǎng)，每2 d觀察菌落生長情況。培養(yǎng)8 d后，有8株菌菌落直徑大于1.5 cm且致密，作為下一步篩選對象。

1.2.4

菌種復篩。

將初篩得到的8株菌預先接入種子培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，然后以5%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d，取出采用紫外分光光度法測定煙堿含量，根據(jù)培養(yǎng)基中煙堿降低量的多少優(yōu)選菌株。

1.2.5

W9菌株的鑒定。 " "對W9菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色。

1.2.6

W9菌株在種子培養(yǎng)基中生長曲線的測定。 " "在600 nm波長下測定種子液的吸光度，以O(shè)D600為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.7

W9菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基A中的生長曲線和降解曲線的測定。 " "生長曲線測定的方法照“1.2.6”進行。降解曲線以發(fā)酵液中所剩煙堿的百分含量為縱坐標，時間為橫坐標繪制。

1.2.8

W9菌株粗酶液的制備。 " "發(fā)酵液培養(yǎng)24 h后，4 ℃，8 000 r/min離心20 min用KH2PO4NaOH，pH 7.0的緩沖液洗滌菌體沉淀（1 000 ml發(fā)酵液菌體中加100 ml緩沖液），超聲波破碎40 min，超聲條件是200 W，超聲2 s，間隔4 s，然后在4 ℃下，8 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.2.9

W9菌株粗酶液對上部煙葉的處理試驗。

利用W9菌株的粗酶液對福建B2F煙葉進行噴施，經(jīng)數(shù)天室內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)后，將未經(jīng)酶液處理的對照和經(jīng)過處理的煙葉分別卷制成煙支，由專業(yè)評吸人員進行對比評吸[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 "具有降煙堿活性微生物的初篩結(jié)果

利用初篩培養(yǎng)基共分離純化得到71株能夠耐受煙堿的細菌，將這71株菌點刺在復篩培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 d后共有8株菌落直徑在1.5 cm以上，確定為下一步篩選的備選菌株。

2.2 具有較高降煙堿活性微生物的復篩結(jié)果

將這8株菌分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基A中搖瓶培養(yǎng)4 d，測定發(fā)酵液中煙堿殘留量，結(jié)果如表1。由表1可以看出，這8株菌降煙堿能力存在較大差異，其中W9菌株降煙堿能力最為明顯，達到80%以上。

表1 初篩得到的8株菌在發(fā)酵培養(yǎng)基A的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果

菌株編號煙堿殘留量∥%降解率∥%

對照1.970

W51.903.36

Tu31.875.37

W70.7163.80

Tu51.941.34

Wu51.856.04

Ⅱ1.4626.20

W90.3880.50

Tu41.5720.10

2.3 菌株鑒定結(jié)果

W9菌分離自延安卷煙廠人工發(fā)酵裝置排放的廢水中，經(jīng)常規(guī)鑒定：W9菌為革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢。

2.4 W9菌在種子培養(yǎng)基中的生長曲線

從W9菌生長曲線（圖1）可以看出，W9菌有較長的延遲期，這可能由于W9菌在沒有煙堿的情況下代謝途徑轉(zhuǎn)換較慢而造成的，此后W9菌進入快速增菌期，其生長對數(shù)期在18～20 h，增菌終止時間為26 h。

圖1 " W9菌在種子培養(yǎng)基中的生長曲線

2.5 W9菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線和降解曲線

圖2表明，菌株W9細胞的生長和對煙堿的降解是同步的，菌株W9生長和對煙堿的降解都有短暫的延遲期，然后進入對數(shù)期，到16 h煙堿降解率達到100%，此時菌體量繼續(xù)增加，這可能由于W9菌在利用完煙堿后，仍能利用培養(yǎng)基中其他碳氮源進行生長繁殖。

圖2 W9菌在發(fā)酵培養(yǎng)基B中生長曲線和降解曲線

2.6 評吸結(jié)果

將W9菌株的粗酶液處理福建B2F煙葉與另一批相同的未被處理的煙葉經(jīng)相同卷煙工藝卷制后，得到成品卷煙進行評吸。結(jié)果得出，處理過的卷煙香氣豐滿，較細膩，刺激性、勁頭明顯降低，余味干凈，較舒適，雜氣掩蓋。

3 討論

該研究從廢水中分離純化得到1株能夠利用煙堿為碳氮源的菌株，該菌具有較強降解煙堿的能力。經(jīng)常規(guī)鑒定為革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢， 以煙堿為單一碳源的平板培養(yǎng)基上生長菌落周圍呈現(xiàn)藍色菌圈。將該菌的粗酶液作用于煙葉發(fā)酵，取得了明顯的效果。試驗過程中，分離純化得到大量降煙堿微生物，有些菌盡管能在選擇培養(yǎng)基上分離出來，但降解率很低，菌株之間降煙堿的能力存在較大差異。

該試驗初步研究了W9菌株及其酶的降解煙堿特性，下一步應(yīng)對W9菌株做更進一步的生化分析以及16sRNA序列同源性分析，確定該菌的種屬關(guān)系以及對其誘變育種，尋找更為高效的降煙堿新菌種。再有就是對其粗酶液進行分離純化，還可將在與其他酶系統(tǒng)混合應(yīng)用研究方面進行更為普遍深入的研究探索。

參考文獻

[1]

張彥東，羅昌榮，王輝龍，等.微生物降解煙堿研究應(yīng)用進展[J].煙草科技，2003（12）：3-7.

[2] 李梅云.煙堿的微生物降解研究進展[J].微生物學雜志，2006，26（3）：94-97.