長期繼代培育對玉米幼胚愈傷組織的影響

摘要 [目的] 研究玉米胚性愈傷組織長期繼代培育的特性變化。[方法]以5種基因型的胚性愈傷組織為材料研究它們繼代10次與20次的特性變化。 [結果]繼代20次愈傷組織的單個培養周期生長量、胚性愈傷組織比率和愈傷組織幼苗再生率和繼代10次愈傷組織相比均有下降，但變化幅度因基因型或愈傷組織類型而不同。Ⅰ型愈傷組織繼代20次后生長量、胚性愈傷組織比率下降明顯，而Ⅱ型愈傷組織相對穩定。[結論]與Ⅰ型愈傷組織相比，玉米Ⅱ型愈傷組織是建立長期玉米組織培養體系的理想材料。

關鍵詞 玉米;愈傷組織;繼代培育;生長量;胚性愈傷;再生率

中圖分類號 S513 "文獻標識碼 A "文章編號 0517-6611（2014）32-11236-02

Effect of Longterm Subculture on Callus from Maize Immature Embryo

DENG Shizheng1， DONG Zhongdong2， LIU Guizhen1，CUI Dangqun2* et al

（1. Seed Station of Henan Province， Zhengzhou，Henan 450046; 2.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450002 "）

Abstract [Objective] The calluses quality changes were studied in longterm subculture condition. [Method] Calluses derived from five maize genotypes were used to investigate the calluses quality change after 10 and 20 times subculture. [Result]The result showed that the growing capacity， embryogenic callus rate， regeneration frequency of callus with 20 times subculture declined significantly compared with those of callus with 10 times subculture. The declines of type Ⅰ calluses which derived from three genotypes were significant， but that of type Ⅱ callus which derived from two genotypes were not. [Conclusion]This demonstrate that during long term subculture， quality of type Ⅱ callus is steady，that of type Ⅰcallus is changeable. So type Ⅱ callus is more ideal for establishing the long term culture system than the type Ⅰcallus.

Key words Maize;Embryogenic callus; Subculture; Growth amount;Embryogenic callus;Regeneration frequency

作者簡介 鄧士政（1960- ），男，河南孟州人，高級農藝師，博士，從事生物技術與品種試驗研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事作物遺傳育種教學與研究。

收稿日期 20140930

玉米組織培養體系是玉米遺傳轉化、突變體篩選和細胞遺傳學研究的基礎[1-5]。Armstrong將玉米愈傷組織分為3類，不同類型的愈傷組織的培養特性不同，其中I型愈傷組織和Ⅱ型愈傷組織被稱為胚性愈傷組織，可以作為建立玉米離體培養體系的基礎材料[5-8]。胚性愈傷組織長期繼代不僅可以省去每年田間種植幼胚供體材料和胚性愈傷組織誘導、篩選的麻煩，而且有利于進行突變體的長期篩選、優良材料的大量擴增和便于靈活掌握遺傳轉化時間。因此，研究胚性愈傷組織長期繼代培育的特性變化，對研究玉米組織培養體系建立及利用具有實際意義。筆者以5種基因型的胚性愈傷組織為材料，研究不同長度繼代時間對不同類型愈傷組織胚性、生長量、再生能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鄭22和齊319 2個自交系和871×鄭22、87-1×齊319、齊319×HiⅡA 3個雜交種的幼胚愈傷組織為長期繼代培養的研究材料，其中齊319和齊319×HiⅡA基因型的愈傷組織為Ⅱ型，其他3種基因型的愈傷組織為Ⅰ型胚性愈傷組織。

1.2 培養基

繼代培養基：N6+2 mg/L 2，4D +500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;

再生培養基：N6+1 mg/L 6BA+1 mg/L KT+500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖。

1.3 試驗方法

幼胚愈傷組織每培養21 d為一個繼代周期，篩選胚性愈傷組織轉換新培養基。在繼代10次和20次時分別測定愈傷組織培養21 d的生長量、胚性愈傷率。所有繼代均采用26 ℃暗培養。生長量測定采用隨機重復設計，重復4次，在轉接繼代時用分析天平稱量接入新繼代培養基的愈傷組織質量，在培養21 d時稱量培養后的愈傷組織質量，然后按下列公式計算生長量：

生長量（g/g）=

繼代培養后愈傷組織質量（g）-接入愈傷組織質量（g）接入愈傷組織質量（g）

按照ARMSTRONG[5] 描述玉米愈傷組織分類標準調查愈傷類型后，計算胚性愈傷率。

分別在繼代10次和20次的上述基因型愈傷組織分化培養基上，每皿接入15塊愈傷組織，26 ℃、14 h/d光照下培養28 d后調查統計再生幼苗數，并按下列公式計算再生率。

再生率（%）=再生幼苗愈傷數誘導再生愈傷組織塊數×100

2 結果與分析

2.1 長期繼代培養對玉米愈傷組織生長量的影響

繼代培養10次和20次的5種玉米基因型愈傷組織轉接相同培養基上培養21 d后愈傷組織生長量在繼代次數、基因型間和繼代次數與基因型互作間均有顯著差異。5種基因型繼代10次的愈傷組織一個繼代周期平均生長量為3.23 g/g，比繼代20次的愈傷組織平均生長量2.46 g/g多0.77 g，達到極顯著水平。除齊319和鄭22間差異不顯著外，其余基因型間愈傷組織生長差異均達到顯著水平;3個雜交種的平均愈傷組織生長量分別顯著高于自交系鄭22和齊319，證明愈傷組織生長具有雜種優勢（圖1）。

不同繼代次數的愈傷組織生長能力差異因基因型及愈傷類型而不同，齊319和齊319×HiⅡA 2個基因型的Ⅱ型愈傷組織2個繼代次數愈傷組織的生長量差異很小，繼代10次的愈傷組織生長量略高于繼代20次的愈傷組織;鄭22、871×鄭22和871×齊319 3種基因型的Ⅰ型胚性愈傷組織繼代10次的愈傷組織生長量為2.14、3.89和4.28 g/g，分別比它們繼代20次愈傷組織生長量多0.74、1.46和1.37 g，達到極顯著水平（圖1）。表明不同類型愈傷組織對長期繼代培養反應不同，Ⅱ型愈傷組織長期繼代生長能力相對穩定，而Ⅰ型胚性愈傷組織下降明顯。

注：每個基因型左側2個柱形上方字母表示該基因型不同繼代次數間在5%水平下的差異顯著情況;右側柱形上方帶短橫的字母表示4種不同基因型間在5%水平下的差異顯著情況。

圖1 不同品種及不同繼代次數愈傷組織生長量差異比較

2.2 長期繼代培養對胚性愈傷率的影響

胚性愈傷率在繼代次數、基因型和繼代次數×基因型互作效應間差異達極顯著水平。5種基因型愈傷組織繼代培養10次后平均胚性愈傷率為85.17%，而繼代20次胚性愈傷率為74.58%，比前者降低10.59%。871×齊319和齊319×HiⅡA 2個基因型平均胚性愈傷率分別為85.17%、85.21%，兩者差異不顯著，但顯著高于其他基因型;871×鄭22和齊319 2基因型平均胚性愈傷率分別為79.79%、78.13%，差異不顯著，但顯著高于鄭22（70.42%）（圖2）。5種基因型愈傷組織2種不同繼代次數的胚性愈傷率變化不同，齊319和齊319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈傷組織，繼代次數間胚性愈傷率變化很小，達不到顯著水平;這2種基因型愈傷組織繼代中的非胚性愈傷組織表現白化或光下變紫。鄭22、871×鄭22和871×齊319 3種基因型的Ⅰ型胚性愈傷組織，繼代20次的胚性愈傷率分別為61.25%、71.67%、80.42%，分別比繼代10次的胚性愈傷率降低18.33%、16.25%、10.83%，差異達極顯著水平（圖2）。這3種基因型愈傷組織繼代中的非胚性愈傷組織表現為褐變。可見，長期繼代培養易造成胚性愈傷組織轉化為非胚性愈傷組織，而這種變化Ⅰ型胚性愈傷組織較大。

注：每個基因型左側2個柱形上方字母表示該基因型不同繼代次數間在5%水平下的差異顯著情況;右側柱形上方帶短橫的字母表示4種不同基因型間在5%水平下的差異顯著情況。

圖2 長期繼代培養對玉米愈傷組織胚性愈傷率的影響

2.3 長期繼代培養對愈傷組織幼苗再生率的影響

將5種玉米基因型的愈傷組織分別在繼代10次和20次后轉接到再生培養基上進行分化誘導，調查28 d內各自的幼苗數，計算幼苗再生率。對愈傷組織幼苗再生率進行方差分析，結果表明繼代次數、基因型和繼代次數×基因型互作差異顯著。5種基因型繼代10次的愈傷組織平均幼苗再生率為32.00%，比繼代20次愈傷組織的平均幼苗再生率26.52%高出5.48%，達到極顯著水平。5種基因型幼苗再生率由高到低依次為齊319×HiⅡA、齊319、871×齊319、871×鄭22、鄭22，分別為41.76%、37.04%、30.74%、22.96%、13.80%，它們之間差異均達到極顯著水平（圖3），說明愈傷組織再生率具有遺傳效應。同一基因型不同繼代次數的愈傷組織再生率差異表現不同。齊319和齊319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈傷組織2個繼代次數再生率差異不顯著，而鄭22、871×齊319、871×鄭22 3種基因型的Ⅰ型愈傷組織繼代10次再生率為18.33%、35.00%、28.33%，分別比繼代20次的愈傷組織再生率高9.07%、7.41%和9.63%，達到極顯著水平（圖3）。可見，Ⅰ型愈傷組織長期繼代培養再生能力下降，而Ⅱ型愈傷組織長期繼代培養再生能力相對穩定。

注：每個基因型左側2個柱形上方字母表示該基因型不同繼代次數間在5%水平下的差異顯著情況;右側柱形上方帶短橫的字母表示4種不同基因型間在5%水平下的差異顯著情況。

圖3 長期繼代培養對愈傷組織幼苗再生率的影響

3 結論與討論

優良玉米愈傷組織的特點是胚性并具有快速擴繁能力和高再生能力[5-6]。該研究利用2個基因型的Ⅱ型愈傷組織和3種基因型的Ⅰ愈傷組織對10次和20次繼代培養后愈傷組織的特性變化進行了研究，證明不同基因型間、不同長度繼代培養次數的愈傷組織間在單繼代周期的生長量、胚性愈傷率和愈傷組織幼苗再生率3個性狀上均存在顯著差異（表1）。說明這3個性狀具有基因型效應和繼代效應。繼代20次的愈傷組織生長量、胚性愈傷組織比率和愈傷組織幼苗再生率和繼代10次的愈傷組織相比顯著下降（圖1、2和3）。對同一基因型不同繼代培養次數愈傷組織生長量、胚性愈傷組織比率和幼苗再生率差異幅度因基因型或愈傷組織類型而不同。Ⅰ型愈傷組織繼代20次后生長量、胚性愈傷組織比