酵母雙雜交表達載體pGADT7—tTGA2的構建及酵母菌的轉化

摘要[目的]研究TGA2在植物系統獲得抗性中所起的作用，闡明其作用機制。[方法]通過PCR擴增獲得擬南芥中TGA2基因全長CDS序列，克隆至pGADT7酵母表達載體，并轉化至AH109酵母菌株中。[結果]重組質粒通過大腸桿菌轉化獲得了陽性克隆，經過菌落PCR及單、雙酶切驗證重組質粒構建成功。將重組質粒又轉化到AH109酵母菌中，并在相應篩選培養基上成功獲得了轉酵母菌成功的陽性克隆。[結論]為進一步研究TGA2參與水楊酸誘導抗性基因表達的作用機制奠定了良好的基礎。

關鍵詞 AtTGA2；CDS克隆；酵母轉化

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10467-02

作者簡介何樂（1990- ），女，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：分子抗性。*通訊作者。

TGA轉錄因子是一類含堿性DNA結合結構域和亮氨酸拉鏈結構域，可以結合到PR1基因啟動子應答性的順式作用元件。它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。該類啟動子通過與NPR1 基因協同作用參與植物對病害的防御作用。具體作用方式為NPR1 寡聚體中的半胱氨酸殘基分子間二硫鍵被水解還原，形成NPR1單體，NPR1單體具完整的核定位序列，使其能夠轉移到細胞核內并與結合在PR1基因啟動子區的TGA類轉錄因子相互作用，調控PR基因的表達和系統性抗性（SAR）的產生[3-6]。不同TGA成員有2種方式與NPR1互作，第一種是TGA與NPR1直接結合，正向調控PR1基因的表達和抗性的產生，兩者結合的強度、保持時間與PR基因表達和抗性產生的強度成正比。如在一些植物體內，在防衛反應啟動子被激活的過程中，TGA因子能與激活子序列（as1）或類as1啟動子元件相結合，如擬南芥中的PR1。連續掃描結果顯示PR1啟動子包括2個類as1元件，即LS7和LS5。LS7是INA誘導過程中的正調控元件，而LS5是一個弱的負調控元件。DESPRES等以這些順式作用元件為探針，進行電泳遷移率改變（EMSA）試驗，結果表明，TGA2和TGA4均能與LS7結合，而TGA2還能與LS5相結合。第2種作用方式是TGA在細胞內有類似NPR1單體——寡聚糖的變化，從而增強PR基因的表達，提高抗性[7-9] 。

為了研究TGA2在植物系統獲得性抗性中的作用，闡明其作用機制，筆者通過構建PGADT7TGA2，利用酵母雙雜交技術尋找與TGA2轉錄輔助因子作用蛋白，為進一步探究TGA2是否參與NPR1轉錄復合體的構成，以及在水楊酸信號傳導途徑中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒與菌株。大腸桿菌DH5α、酵母菌株AH109、表達載體pGADT7均由湖南農業大學脂肪酸代謝實驗室提供。

1.1.2試劑。Yeast Nitrogen Base（購自sigma公司）；PEG4000、LiAc、SD/trp DO supplement（購自clontech）；CarrierDNA、EDTA、Glucose、agar powder、yeast extract peptone、DMSO（均購自歐邁生物）；EasyTaq DNA Polymerase、pEASYBlunt Simple Cloning Kit（均購自全式金公司）；質粒提取Kit、DNA膠回收Kit、DNA Maker（購自Ambiogen公司）。

1.2方法

1.2.1引物設計。根據TAIR上已公布的TGA2基因編碼區序列，查找到TGA2基因CDS（其中TGA1長1 107，TGA2長993），參照酵母表達載體pGADT7的表達框及多克隆位點，運用Primer Premier5引物設計軟件進行設計。引物序列：TGA1F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGAATTCGACATCGACACA 3′，TGA1R：5′ CGGGATCCCGCTACGTTGGTTCACGATGTC 3′；TGA2F：5′ TCCCCCCGGGGGGA ATGGCTGATACCAGTCCGAG 3′，TGA2R：5′ CGGGATCCCGTCACTCTCTGGGTCGAGCAAG 3′。

1.2.2PCR擴增。 高保真EasyTaq DNA Polymerase PCR的擴增體系為50 μl，正向引物（10 μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各1 μl，dNTP 4 μl，10×EasyTaq Buffer 5 μl，EasyTaq DNA Polymerase 0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 22.5 μl。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，16 ℃保存，擴增30個循環。

1.2.3pEASY載體連接及大腸桿菌轉化。連接反應體系（5 μl）：DNA 4 μl，pEASYBlunt Simple Cloning Vector 1 μl。

1.2.4酵母雙雜交載體構建。用BamHI和XmaI對連接pEASY載體的TGA2質粒進行雙酶切，酶切體系（20 μl）如下：載體pGADT7 14 μl，Buffer 2 μl，酶1 μl，ddH2O 2 μl，瓊脂糖電泳后回收目的基因片段和表達載體片段。T4連接酶連接體系中分別將目的基因片段與表達載體片段連接，轉入大腸桿菌。挑取陽性克隆進行PCR驗證，并提質粒進行酶切驗證。

1.2.5重組質粒轉化至酵母AH109菌。

1.2.5.1酵母感受態細胞的制備。接種2～3個AH109單菌落于5 ml YPD中，放置于30 ℃、250 r/min的搖床中培養18 h，然后放于50 ml YPD溶液中擴大培養3 h，至OD值為0.5。

1.2.5.2重組質粒的轉化。將重組質粒pGADT7TGA2采取PEG/LiAc法轉化至酵母菌AH109，30 ℃恒溫培養2～3 d。

2結果與分析

2.1PCR擴增擬南芥TGA2基因以58 ℃為退火溫度進行PCR擴增，產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離出目的片段，大小與預期一致（圖1）。

2.2TGA2全長CDS與TVecor連接使用T4連接酶將切膠回收擴增的目的片段分別與pEASYBlunt Simple Cloning Vector 連接，熱激法轉化至大腸桿菌DH5α，取菌液涂布于含50 mg/ml的氨芐青霉素LB固體培養基上生長至長出菌落。挑取陽性克隆進行菌落PCR檢測，獲得轉化子。

將菌落PCR檢測為陽性的單菌落，接種至含50 mg/ml的氨芐青霉素LB液體培養基中，放置于37 ℃搖床，220 r/min振蕩培養過夜。提取質粒，利用BamHI和XmaI進行雙酶切驗證。挑選驗證正確后的克隆測序，測序結果與已公布的擬南芥TGA2基因全長CDS序列一致。

2.3酵母表達載體構建將連接在pMD19T上的TGA2片段與載體pGADT7分別經BamHI、XmaI雙酶切后，用T4連接酶連接，構建酵母雙雜交表達載體pGADT7TGA2。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α培養，獲得陽性克隆，進行單、雙酶切驗證，電泳得到一條約1 000 bp的條帶（圖2），表明載體已經構建成功。用BamHI進行單酶切時出現多條帶可能是由于單酶切體系中錯誤識別堿基序列并進行切割或者由于質粒在大腸桿菌中進行復制時出現堿基突變所致。

2.4重組質粒的酵母菌轉化將重組質粒pGADT7TGA2轉化至AH109菌株中，涂布于SD/Leu培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d，酵母菌生長情況見圖3。結果證明重組質粒轉化成功。

3小結與討論

在各種植物防御途徑中，SA介導的系統獲得性抗性（SAR）已有大量報道，且被認為是植物應對細菌性病害過程中十分關鍵的機制。SAR過程發生在受感染植株的健康部位中。植物局部組織受到病原菌侵染后，一類可移動的信號分子通過維管系統運輸至其他部位并啟動相應的免疫應答反應，如激素水平提高、防御基因表達、次級代謝物累積、形態學改變等。水楊酸作為SAR信號途徑起始位點中心必不可少的一種信號分子，它介導一大類編碼具有抗菌作用的蛋白質的基因表達[10-15]。在水楊酸信號傳導途徑中，NPR1被證明是必需的一個反式作用因子。水楊酸信號導致細胞內氧化還原電勢的改變，NPR1被轉運進入到細胞核內，并與一些轉錄因子相互作用，進而調控防御基因的轉錄。研究表明，NPR1在SA誘導下與一些轉錄因子結合，形成轉錄復合體，以啟動下游基因表達。據報道，轉錄復合體可能包含以下蛋白：SABP、SABP2、SABP3、TGA轉錄因子，WRKY轉錄因子。轉錄因子在植物生長和發育期間的轉錄水平調控上起著重要作用，指導DNA和蛋白質相互作用，從而調控基因的表達。由于TGA類啟動子與基礎防御基因PR1、NPR1 作用關系緊密，在抗病研究中的關鍵性與重要性逐漸顯現[8，16-19]。