篩選產纖維素酶菌株及其產酶條件的優(yōu)化

摘要[目的]篩選降解菌糠纖維素的菌株，并且優(yōu)化其發(fā)酵條件。[方法]采用纖維素-剛果紅培養(yǎng)基進行篩選，篩選出纖維素酶活較高的菌株。通過比較不同氮源、碳氮比例等條件下CMC酶活，研究其最佳發(fā)酵條件。[結果]選出一株酶活較高的菌株，命名為N3。其最適有機氮源為豆餅粉，無機氮源是（NH4）2SO4。最適合N3 產酶的（NH4）2SO4∶豆餅粉比例為 2∶4。最適碳源氮源比例為 5∶2。[結論]N3是一株具有研究價值的產纖維素酶的菌株。

關鍵詞 纖維素酶；篩選；發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10441-02

基金項目黑龍江省財政預研項目。

作者簡介葛江麗（1981- ），女，山東鄆城人，工程師，碩士，從事植物生理、微生物和細胞生物學方面的研究。

我國是食用菌生產消費大國。2010年我國食用菌總產量達2 000萬t，占世界的70%。在食用菌產業(yè)迅猛發(fā)展的勢頭下，隨之而來的大量廢棄菌糠如何處理又是擺在我們面前亟需解決的問題。長期以來，廢棄菌糠一般被廢棄、焚燒，這樣既浪費資源又污染環(huán)境。另外，能源問題已成為人類社會發(fā)展的重要制約因素。為了緩解這一危機，發(fā)展新型的可再生能源已成為世界各國主要的發(fā)展目標。燃料乙醇是目前國際上運用較成功的替代能源之一。有關燃料乙醇的研究和應用已被許多國家擺到重要的戰(zhàn)略地位。要想將木質纖維素轉化為生物燃料，就要先將其分解成單糖。具有優(yōu)良性狀的產纖維素酶活性菌株的使用，是纖維素資源能否高效利用的關鍵。

國內雖然有了大量篩選纖維素酶的研究[1]，來自自然界中的土壤、水體、腐殖質及生物體內等環(huán)境條件下纖維素酶不斷被發(fā)掘，但迄今為止，我國仍未很好地解決規(guī)模生產纖維素酶的難題。長期以來，酶的產量、比活力低一直是制約纖維素酶實際應用的一個重要原因[2]。因此，不斷地篩選高產纖維素酶菌株，對纖維素資源的利用有著重要的意義。筆者從土壤、腐殖質和牲畜糞便中篩選出能夠高效降解菌糠纖維素的菌株，以菌糠為碳源，通過比較不同氮源、碳氮比例等條件下CMC酶活，探討其高效產酶的發(fā)酵條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集。樣品于2014年4月分別采自黑龍江省牡丹江市池塘邊的泥地、高速公路旁的泥土、山上的腐殖土、動物糞便和農作物的腐殖堆。

1.1.2培養(yǎng)基。

1.1.2.1赫奇遜營養(yǎng)液。磷酸二氫鉀 1.00 g，氯化鈉 010 g，硝酸鈉 2.50 g，硫酸鎂 0.30 g，三氯化鐵 0.01 g，氯化鈣 010 g，蒸餾水 1 000 ml，pH 7.2 左右。

1.1.2.2纖維素-剛果紅培養(yǎng)基。磷酸氫二鉀 0.50 g，硫酸鎂 0.25 g，微晶纖維素 2.00 g，剛果紅 0.20 g，瓊脂 4.00 g，蒸餾水 200 ml，pH 7.0。

1.1.2.3以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基。在 100 ml 赫奇遜（Hutchison）營養(yǎng)液中加入微晶纖維素 1.00 g，瓊脂 2.00 g。

1.1.2.4以菌糠為唯一碳源的液體培養(yǎng)基。在 50 ml 赫奇遜（Hutchison）營養(yǎng)液中加入菌糠 0.50 g，置于 250 ml 三角瓶中。

1.1.2.5種子培養(yǎng)基。蛋白胨5.00 g，酵母膏1.00 g，硫酸銨3.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂0.50 g，氯化鈣0.10 g，氯化鈉0.10 g，葡萄糖20 g，硫酸亞鐵 0.005 g，硫酸鋅0.001 4 g，硫酸錳0.001 6 g，氯化鈷0.002 g，蒸餾水1 000 ml。

1.1.2.6產酶培養(yǎng)基。菌糠2600 g，硫酸銨1.89 g，磷酸二氫鉀 5.31 g，硫酸鎂0.30 g，氯化鈣0.30 g，吐溫1.50 g，硫酸亞鐵 0.005 g，硫酸鋅0.001 4 g，硫酸錳0.001 6 g，氯化鈷0002 g，蒸餾水1 000 ml。

1.2方法

1.2.1產纖維素酶菌株初篩。分別稱取土壤等樣品 1 g，放入裝有玻璃珠和99 ml無菌水的三角瓶中，在搖床中 160 r/min振蕩30 min。然后，制成 10-1、10-2、10-3、10-4的各種稀釋度的樣品溶液。取 10-2、10-3、10-4 3種稀釋度的土壤樣品溶液各 0.2 ml，用無菌玻璃涂棒在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基平板表面輕輕地均勻涂布。將平板置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。

1.2.2產纖維素酶菌株復篩。 將初篩分離得到的 36 株菌用無菌牙簽分別點接到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上。 將上述平板置于 30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d。選取 7株在纖維素剛果紅培養(yǎng)基中生長良好（菌落直徑大、透明水解圈大）的菌株，接種于以菌糠為唯一碳源的液體培養(yǎng)基的搖瓶中連續(xù)培養(yǎng) 5 d，測定發(fā)酵液的酶活力。

1.2.3粗酶液的制備。將上述篩選出來的菌株接種于產酶培養(yǎng)基中，于 28 ℃ 恒溫搖床培養(yǎng) 5 d，搖床轉速 160 r/min。然后，發(fā)酵液經5 000 r/min 離心 10 min，除去菌體后得粗酶液。

1.2.4酶活力測定。

1.2.4.1標準曲線的繪制。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml葡萄糖于5支試管中，均用蒸餾水稀釋至2 ml，加3，5二硝基水楊酸顯色劑2 ml，在沸水浴中煮沸顯色10 min，冷卻，稀釋5倍。以1 ml蒸餾水代替糖作空白管，在550 nm處比色。以光密度為縱坐標，以葡萄糖微克數為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.2樣品測定。取濃度0.5%羧甲基纖維素鈉溶液0.5 ml、酶液0.5 ml于50 ℃水浴中糖化30 min，取出，立即于沸水浴中煮沸10 min，使酶失活，得糖化液，冷卻，加入2 ml顯色液，再沸水浴10 min，冷卻后加水定容稀釋5倍，混勻，550 nm測OD值。

1.2.5纖維素分解菌液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.5.1氮源對產酶的影響。在碳源固定在2333 g/L的情況下進行氮源對產酶影響的試驗。每瓶氮源含量為2 g/L，得到最佳的無機和有機2種氮源。

1.2.5.2氮源比例對產酶的影響。在總量為2 g/L的情況下將2種氮源按質量比6∶0、5∶1、4∶2、3∶3、2∶4、1∶5和0∶6混合，比較不同比例氮源的產酶效果。

1.2.5.3碳氮比例對產酶的影響。在碳源固定在2333 g/L的情況下，氮源依次為133、267、400、533、667、800、700、1067 g/L，得到最佳產酶碳氮比。

2結果與分析

2.1纖維素分解菌的篩選通過以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基篩選得到的36株菌株中，有19株來自池塘邊的泥地，11株來自山上的腐殖土，5株來自高速公路旁的泥土，1 株來自農作物的腐殖堆。 將上述 36 株菌株接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，7 d后觀察其生長情況（表1）。

部分菌株如C11、C12雖然可以在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上很好的生長，但幾乎沒有透明圈產生，說明這些菌株可以利用纖維素為碳源，但并非通過水解產生單糖或多糖這一代謝途徑，而是有其他非水解途徑。

2.2搖瓶篩選選取表1中菌落大小水平和水解圈大小水平都較高的 7 株菌株，接入以菌糠為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，菌株N1、N2、N3、N4、T1、T2、F1 CMC酶分別為2.31±0.31、3.58±0.21、22.47±0.32、21.39±0.21、11.17±0.23、10.66±0.12、9.23±0.08。菌株N3的CMCase最高，所以下面的試驗以菌株N3為研究對象。N3在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上形成的透明圈見圖1。

2.3培養(yǎng)基成分對產纖維素酶的影響

2.3.1氮源的影響。 氮是組成蛋白質和核酸的主要元素。酶的本質是蛋白質。微生物的生長代謝也離不開氮源。雖然氮源不作為誘導纖維素酶的誘導物，但其種類對產酶有較大的影響。由圖2可知，在提供的氮源中，N3產CMC酶的最佳無機氮源是（NH4）2SO4，有機氮源是豆餅粉。所以，選用（NH4）2SO4和豆餅粉作為N3的最佳無機、有機氮源。

2.3.2氮源比例的影響。由圖3可知，當（NH4）2SO4 和豆餅粉比值為（6∶0）～（2∶4）時，CMC酶緩慢增加，到2∶4時N3產CMC酶增至最大。所以，N3產酶最佳氮源（NH4）2SO4 和豆餅粉比值為 2∶4。

2.3.3碳氮比例的影響。由圖4可知，當氮源含量為 0.28 g時CMC酶最高（23.068）。所以，N3的最佳產酶氮源含量為 0.28 g。此時，碳源、氮源的比例為 5∶2。