桂林貓兒山蘇云金芽孢桿菌的篩選及抑菌性研究

摘要[目的]探明桂林市貓兒山風景區Bt的多樣性和分布概況。[方法]在該景區海拔1 800 ～2 000 m的常綠針闊葉林和海拔2 000 m以上的灌叢矮林采集土壤樣品共1 168份，分離Bt菌株，并對Bt分離株進行伴孢晶體蛋白分子量的測定和發酵上清液抑菌性分析。[結果]從該景區針闊葉林和灌叢矮林的146個樣點共篩選出44個Bt菌株，出菌率達30.14%；其中14株Bt菌株均表達120 kD的蛋白，12株表達66 kD的蛋白。將14株Bt分離株的發酵液上清進行抑菌檢測，僅有4株對草生歐文氏桿菌有抑制效果，其中9號的Bt分離株抑制率最高。9號Bt分離株發酵液上清的抑菌物質熱穩定性研究結果表明抑菌物質在65 ℃下2 h內不失活，其至少含有2種抑菌物質。[結論]為豐富我國西部地區Bt資源的開發利用奠定了基礎。

關鍵詞 蘇云金芽孢桿菌；SDSPAGE；伴孢晶體；抑菌

中圖分類號S481文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）30-10561-03

基金項目廣西礦冶與環境科學實驗中心資助項目（KH2013YB013）；廣西自然科學基金項目（2014GXNSFBA118134）；廣西壯藥產業化工程院科研項目（2014GXZYCYH03）。

作者簡介李霞（1981- ），女，黑龍江肇東人，講師，博士，從事天然化學產物活性研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事天然化學產物活性的研究。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， 簡稱Bt），化能異養型革蘭氏陽性細菌，其利用的碳源主要為單糖和淀粉[1]。Bt主要特點是能產生特異性毒殺作用的伴孢晶體（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs），迄今Bt的殺蟲活性譜已經擴大到無脊椎動物4個門及節肢動物中9個目的動物[2]。Bt在發酵過程產生可溶性的抗生素（Zwittermicin A， 簡稱ZwA）[3]，能抑制多種微生物的生長，與Bt伴孢晶體混用時具有很高的增效作用[4-5]。目前Bt制劑已成為全球用途最廣、產量最大的微生物類殺蟲劑，具估計目前全世界分離保存的Bt菌株已達4萬多株[6]。伴隨著Bt制劑廣泛應用于農業生產中，害蟲也隨之逐漸產生抗性。因此，對我國境內Bt菌株進行分離和研究，發掘新型Bt基因，尋找具有廣譜殺蟲性質的Bt，具有廣闊的商業前景和科研價值。

Bt菌株廣泛分布于自然界，不同地域中表現出來的特性也有所區別。貓兒山風景區位于廣西東北部，海拔高度2 141.5 m，森林覆蓋率達96.5%，常綠針闊葉林，土壤肥沃，植被豐富，水源豐沛，適合于土壤微生物的生存；灌叢矮林，晝夜溫差懸殊，日照充足，適于抗性強的微生物生存。為了探明該地區Bt的多樣性和分布概況，在該地區海拔1 800～2 000 m的常綠針闊葉林和海拔2 000 m以上的灌叢矮林[7]采集土壤樣品共1 168份，分離Bt菌株，并對Bt分離株進行了伴孢晶體蛋白分子量的測定和分離株的發酵上清液抑菌性分析，旨在為豐富我國西部地區Bt資源的開發利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。Bt庫斯塔克亞種菌株HD1（簡稱HD1）和草生歐文氏桿菌（Erwinia herbicola LS005）均由中國農業科學院植物保護研究所提供。

1.1.2試劑。石炭酸復紅染液：2 g堿性品紅溶于20 ml含5%苯酚的酒精，使用時稀釋15倍。

1.1.3培養基。1/2LB固體培養基：蛋白胨0.50%，酵母粉0.25%，氯化鈉0.50%，瓊脂粉1.50%。發酵培養基：葡萄糖2.000 0%，蛋白胨2.000 0%，無水氯化鈣0.080 0%，磷酸氫二鉀0.130 0%，硫酸鎂0.020 0%，硫酸錳0.000 8%，調節pH至7.0～7.2。

1.2方法

1.2.1土樣采集。使用經緯儀，以經緯度為坐標圓點，在半徑為5 m的范圍內隨機采集8份土壤樣品，選取植被豐富、潮濕、避免陽光直射的腐殖層，采集腐殖層下5～15 cm的土壤，裝入無菌的自封袋中，記錄坐標圓點的經緯度和海拔。

1.2.2Bt菌株分離。坐標點的8份土壤中，每份取2 g混于15 ml離心管中，加入無菌玻璃珠和無菌水至離心管刻度15 ml處，使用旋窩混合器振蕩混勻，置于80 ℃水浴20 min。取上清液稀釋成10-2和10-4 2個梯度，吸取100 μl于1/2LB固體培養基中均勻涂布，30 ℃恒溫箱中倒置培養40～50 h。

1.2.3Bt菌株鑒定。觀察菌落在1/2 LB固體培養基上的生長情況，挑選菌落顏色為乳白色、形態呈圓形、邊緣呈鋸齒形的菌株進行制片。使用石炭酸復紅染液對涂菌部位染色5 min，隨后自來水沖洗至洗液為無色，晾干，100倍油鏡觀察伴孢晶體的有無及伴孢晶體的形態，計算出菌率。

出菌率=Bt分離株數量/采樣坐標點數目

1.2.4Bt分離株伴孢晶體SDSPAGE分析。將Bt分離株接種于1/2 LB固體培養基中劃線，30 ℃恒溫箱中倒置培養至Bt伴孢晶體釋放。刮取2 mg左右菌株制備SDSPAGE待測液，待測液制備和SDSPAGE分析參見文獻[8-9]。將凝膠圖片使用軟件“UVITec”處理，直接得到蛋白分子量數據。

1.2.5Bt分離株發酵液上清抑菌效果檢測。將Bt分離株于1/2 LB液體培養基中30 ℃恒溫搖床活化18 h，以2%的接種量接種于發酵培養基，30 ℃恒溫搖床培養48 h，取發酵培養液，4 500 r/min離心15 min，上清液作為待測液。使用草生歐文氏桿菌作為指示菌，對Bt分離株進行伴孢晶體的SDSPAGE電泳分析，采用牛津杯法[10]觀察Bt分離株發酵液上清對其抑制的效果。以HD1為陽性對照，發酵液為陰性對照，將Bt分離株發酵液上清于95 ℃水浴2 h，以室溫下Bt分離株發酵液上清作為對比進行抑菌試驗。測量每個孔徑抑菌圈的大小，計算各待測液與Bt菌株HD1抑菌圈直徑和直徑比值。

抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-抑菌圈內徑

直徑比值=待測液抑菌圈直徑/HD1抑菌圈直徑

1.2.6Bt分離菌發酵液上清中抑菌物質熱穩定性研究。使用比HD1抑制草生歐文氏桿菌效果好的Bt分離株，將分離株發酵液上清以65、80、95 ℃分別水浴加熱15、30、45、60、75、90、105、120 min。使用草生歐文氏桿菌作為指示菌，采用牛津杯法[10]，觀察其抑制效果。以水浴時間為橫坐標（x），抑菌直徑為縱坐標（y），繪制回歸曲線。

2結果與分析

2.1菌株分離貓兒山景區共設146個坐標點，采集1 168份土壤，分離鑒定出Bt菌株44株，出菌率為30.14%；針闊葉林設定127個坐標點，采集1 016份土壤，共分離鑒定出Bt菌株41株；灌叢矮林19個坐標點，采集152份土壤，共分離鑒定出Bt菌株3株（表1）。針闊葉林的出菌率（3228%）遠高于灌叢矮林（15.79%），其原因可能灌叢矮林帶與針闊葉林帶相比海拔較高，日照較強，土壤濕度較低，腐殖層較薄。

2.2菌株形態和伴孢晶體形態觀察于光學顯微鏡100倍油鏡下進行觀察，發現41株Bt分離株的伴孢晶體均為菱形（圖1），未發現其他形態的伴孢晶體。其原因可能為貓兒山地區土壤中的Bt的伴孢晶體均為菱形。注：a.伴孢晶體； b.芽孢； c.營養體。

2.3晶體蛋白的SDSPAGE分析分離出Bt的14個采樣坐標點，每坐標隨機取1株Bt分離株進行伴孢晶體的SDSPAGE電泳分析，共取14株Bt分離菌株（表2）。14株Bt的伴孢晶體均表達了120 kD的蛋白，12株Bt的伴孢晶體表達了66 kD的蛋白，預測貓兒山的Bt菌株伴孢晶體均含120 kD的蛋白，絕大部分含有66 kD的蛋白。14株Bt分離株中，5株表達了3種分子量，3株表達5種分子量，3株表達4種分子量，2株表達7種分子量，1株表達9種分子量。其中2號Bt分離株表達了9種分子量，該菌株可能為含有新型Bt基因的野生菌株，需要進一步研究。

2.4Bt分離株發酵液上清抑菌效果將14株Bt分離株的發酵液上清，以草生歐文氏桿菌為指示菌進行抑菌效果檢

2.5Bt分離菌發酵液上清中抑菌物質熱穩定性使用9號Bt分離株發酵液上清進行抑菌物質熱穩定性研究，繪制熱穩定性的回歸曲線（圖2）。65 ℃水浴15～120 min的抑菌率區域穩定，說明抑菌活性物質在65 ℃下2 h以內不失活；80 ℃水浴15～120 min的抑菌率波動性較大，推測抑菌活性物質在該溫度2 h內既有增強也有減弱；95 ℃水浴60 min后區域穩定，推測至少含有2種抑菌物質。

3結論

從桂林市貓兒山景區針闊葉林和灌叢矮林的146個坐標點的土壤中共篩選出44株Bt，進一步豐富了我國西部地區的Bt資源庫；14株Bt分離株所表達的蛋白呈現的多元化顯示了貓兒山景區Bt的多樣性，9號Bt對草生歐文氏桿菌的高抑制率以及其抑菌活性物質的穩定性和多元性，值得進表3Bt分離株發酵液上清抑菌效果

參考文獻

[1] 王利平， 代林遠， 李鵬.蘇云金芽孢桿菌研究進展[J].中國畜牧獸醫， 2011， 38（9）： 224-227.

[2] 喻子牛， 孫明， 劉子鐸.蘇云金芽孢桿菌的分類及生物活性蛋白基因[J].中國生物防治， 1996（12）： 89-89.

[3] SILOSUH L A，LETHBRIDGE B J，RAFFEL L A，et al.Biological activities of two fungistatic antibiotic produced by Bacillus cereus UW85[J].Applied and Environmental Microbiology， 1994，60：2023-2030.

[4] MANKER D C，LIDSTER W D，STAMES R L，et al.Synergy between Zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki against gypsy moth （Lepidopteria： Lyman triidae）[J].Biological Control， 2000， 29（1）： 101-107.