變性梯度凝膠電泳（DGGE）的研究進展

【摘 要】DGGE 技術是由Fischer等于1979年提出的一種用于檢測DNA突變的電泳技術[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夾子”，使得突變檢出率大大提高，從而進一步完善了該技術。1993年，Muyzer等將DGGE技術應用于微生物的生態學研究，并且證實了該技術在研究自然界微生物群落的種群差異性和遺傳多樣性方面具有突出的優越性[2]。與傳統的菌種分離培養技術及生理生化指標檢測相比，DGGE技術通過對微生物群落的核酸信息進行分析，能更準確、更快速的對菌群進行鑒定，同時可鑒定出自然狀態下不可培養的菌株。由于DGGE技術具有重現性高、可靠性強和高效快捷等優點[3]，現以用于微生物群落的復雜性分析、檢測微生物種群動態變化、對比細菌的富集培養及分離培養、單基因組中rRNA的多樣性分析、DNA提取方法比較等方面，在廢水、海洋、森林、土壤等環境樣品研究以及發酵工藝、植物內生真菌研究、種群演替規律研究等領域廣泛應用。

【關鍵詞】DGGE；微生態；純培養

1.DGGE技術的原理

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是根據小片段DNA分子（1kb以下）的熔解溫度不同來分析DNA分子的多樣性，理論上可以檢測到單個堿基替換的DNA分子。DNA片段在丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于自身的物理性狀，熔解狀態的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度比雙鏈DNA分子慢[4]。當DNA片段處在變性劑濃度不斷增加的凝膠系統中，隨著電泳的遷移就會部分融化，達到一定變性劑濃度時DNA就會熔解為單鏈的分子，這些離散的碎片集中在一個比較狹窄的變形梯度范圍內，這樣不同的DNA分子在不同變性劑濃度下熔解，在整個電泳圖譜中成樓梯式排列。通過對比熔解狀態下DNA片段的多態性，就可以推測有堿基突變或序列差異的DNA分子片段。

為了提高檢出率可在DNA一端加入一個高熔點區—GC夾（GC clamp）；GC夾就是在一側引物的5′端加上一個30～40bp的連續GC堿基，這樣在PCR產物的一側可產生一個GC夾的高熔點區，從而使相應的部分序列處于低熔點區而便于檢測分析；這樣，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%[4]。

2.DGGE技術在微生物生態學中的應用

自然界中85%～99.9%的微生物是不可純培養的[5]，并且微生物的形態具有難觀測性和可變性，在傳統的實驗方法下不能提供足夠的微生物學信息，這嚴重阻礙了對自然環境中微生物構成及特征的客觀認識。PCR-DGGE 技術在微生物生態學中的一個最主要的應用就是分析微生物群落構成，Muyzer 等人于1993年首次將DGGE技術應用于微生物膜系統和生物菌苔的群落多樣性分析。此后，該技術被廣泛應用于各種微生物生態系統的檢測，絕大部分研究都是通過擴增原核生物 16S rDNA 基因來研究各生態系統中的古細菌或細菌的群落多樣性[6]，或者用真菌的通用引物擴增18SrDNA 基因，從而研究真菌的群落多樣性，另外除了通過rDNA基因來分析微生物群落結構組成外，還可以通過擴增功能性基因來研究功能基因及功能菌群的差異。

Lam等利用DGGE技術對真菌18SrDNA的序列進行分析，研究Magnolia liliifera葉片中真菌的多樣性，結果在葉片的不同部位得到通過培養和形態學研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等對挪威紅杉殘枝樣本直接進行DNA提取，利用DGGE分析通過FR1和NS1引物對擴增的1650 bp rDNA片段，結果得到了46株木材腐爛真菌，為真菌群體中難培養的菌株的檢測提供了新的方法[8]。Zhou等對藏靈菇發酵液里的真菌和細菌的DNA進行提取后，擴增細菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相應片段，之后用DGGE進行分析得到11株優勢菌株，并且在不同樣本之間細菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。

PCR-DGGE 技術在微生物生態學中的另一個重要應用是檢測微生物的動態變化。宋亞娜等運用16SrDNA和18S rDNA特異性引物對，將土壤中提取的總DNA進行PCR擴增后，通過DGGE技術對PCR產物進行分析，研究不同間作和輪作種植體系對作物根際真菌和細菌菌落結構的影響，結果表明，間作明顯改變玉米的根際細菌、真菌的菌落結構[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化學熏蒸后對散土和菠菜根部土壤中真菌群落的變化，結果表明，三氯硝基甲熏蒸兩個月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多樣性都減少，并且一年后真菌的多樣性并沒有完全恢復到原來的水平，但是菠菜根部土壤中真菌減少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯處理兩個月后，真菌的多樣性只發生微小的改變，并且六個月后就與對照組沒有顯著差異了[11]。

PCR-DGGE技術還可用于發現新的微生物菌株。Santegoeds等通過DGGE分析細菌16SrRNA上的基因片段來檢測多次富集培養的菌藻系，得到了14條獨特的16SrRNA基因序列，其中有10個細菌株的基因是以前利用純培養手段及單純的分子技術方法均沒有發現的[12]。

3.DGGE技術的局限性及改進方法

DGGE 技術作為一種分子生物學手段在研究微生物群落的動態行為和復雜性方面發揮著重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物學工具，但是作為一種分子水平上的技術，除了具有多數分子技術所固有的缺點之外（如PCR產物偏差等），本身也有一定的應用局限性。

首先，利用DGGE分離的PCR產物一般要求DNA長度在200～ 700bp范圍內[1]，超出該范圍DGGE的分辨率會下降，然而這些序列只能提供有限的系統發育信息，不利于判斷微生物所屬的系統類群。其次，DGGE通常顯示的是微生物群落中的優勢種群，Muyzer研究發現該技術只能對菌體數量大于總菌量1%的菌群進行分析[1]。再次，每種菌可能含有數目不等的rRNA基因[13]，則可能會導致群落中菌株數量被過多的估計從而夸大群落差異性和多態性。另外，如果選用的條件不是特別適宜就不能保證將每類DNA片段完全分開，這樣序列不同的DNA片段遷移到凝膠的同一位置，導致同一條帶中含有不同種類的細菌[14]。

對于DGGE存在的這些缺限我們可以通過各種手段加以改善，例如可以優化電泳及PCR的條件從而減少誤差，并且在進行DGGE之前通過軟件來分析檢測PCR過程中形成的嵌合體，另外，可以與其他技術方法相結合，如純培養、直接形態觀察、原位雜交、核酸探針檢測技術等，這樣不僅更客觀的從多方面反映環境中微生物的多樣性信息，還可以與其他方法相互補充，從而不斷提高分子微生物生態學的研究水平。DGGE技術與傳統方法或其它分子生物技術的結合進一步促進了人們對微生物生態的認識；隨著分子生物學技術的快速發展，DGGE技術將會得到不斷的補充和完善，必將在微生物生態研究中發揮更大的作用。

【參考文獻】

[1]Fischer S G，Lerman L S.Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis[J].Cell，1979，（16）：191-200.

[2]MuyzerG，Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerasechain reaction amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，59：695-700.

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