血清EBV-DNA檢測在膿毒血癥中臨床意義

【摘要】背景與目的：血培養是確定膿毒血癥病因的主要手段，據統計，最常見的致病菌主要是：大腸桿菌、綠膿桿菌以及Klebsiella肺炎桿菌。但臨床上有很多病例出現血培養陰性，經檢查發現血清中EBV成陽性，在血清中監測EBV DNA水平對血培養陰性膿毒血癥患者的臨床意義尚缺少研究報道。 EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種人類皰疹病毒，基因組為雙鏈DNA。世界上90%人群成年前均感染過EBV[1]大多數正常人攜帶EBV，這種原處于靜止狀態的病毒一旦處于活化狀態。EBV DNA可整合至細胞染色體，是EBV持續潛伏感染的另一種方式，代表了病毒一細胞相互作用的又一種機制[2]。本研究定量檢測膿毒血癥血培養陰性患者血清EBV DNA含量，探討其在監測膿毒血癥發生和發展臨床意義。方法：選擇在我院門診隨診的血培養陰性膿毒血癥患者20例和健康成年志愿者20例，用熒光定量PCR方法檢測血清EBV DNA含量，比較血培養陰性膿毒血癥患者與健康成年志愿者血清EBV DNA拷貝數。結果：血培養陰性膿毒血癥患者血清EBV DNA的檢出率為30%，中位拷貝數為2 650 copies/ml(O -5 900 000 copies/ml)；而正常對照組患者血清EBV DNA檢出率0%，中位拷貝數為0 copy/ml(0 - 71000copies/ml)，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論：血清EBV DNA定量檢測可證明血培養陰性膿毒血癥患者存在EBV感染的病毒血癥。

【關鍵詞】膿毒血癥；血培養陰性；熒光定量PCR； EB病毒DNA；

【中圖分類號】R4【文獻標識碼】A【文章編號】1671-8801（2014）06-0011-03

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)

本研究擬采用熒光定量PCR技術對20例血培養陰性Sepsis患者血清EBV DNA進行定量分析，探討血清EBV DNA含量在診斷膿毒血癥中的臨床意義。

1資料和方法

1.1病例資料

選擇自2009年3月至2011年10月在湖南省人民醫院門診隨診的血培養陰性膿毒血非燒傷致膿毒癥患者20例， 其中男性11例，女性9例，中位年齡49(23 -65)歲。原發病包括呼吸系統感染10例， 消化系統感染7例， 神經系統感染3例。治愈15例， 死亡5例。所有患者入院時均出現SIRS， 其中并發MODS 10例， 感染性休克15例。所有病例均排除其他引起血清中EBV感染可能的疾病， 無基礎代謝性疾病， 未行脾及胸腺切除， 不包括腫瘤、自體免疫性疾病等確切影響免疫及使用放、化療和激素、免疫制劑治療者。正常對照組血清取于22-28歲健康志愿者，既往無EBV感染相關病史。抽取每個患者外周血3 ml于分離膠促凝管中，4 000 r/min離心10 min后分離上層血清，于- 80C凍存。

1.2DNA抽提

用QIAmp DNA Blood Kit（購自德國Qiagen公司）抽提血清DNA，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.3引物及探針的設計及合成

引物、探針的設計及合成均在上海生工完成。所擴增的目的基因來自EB病毒的BamH i-w片段。上、下游引物分別為W-44F（5'-AGTCT CTGCC TCCAG GCA-3’）和W-119R(5’一ACAGA GGGCC TGTCC ACCG-3’)。在該PCR反應體系中加入一個雙末端標記的熒光探針，探針的序列為5'-(FAM) CACTG TCTGT AAAGT CCAGCCTCC (TAMRA)-3’。上述引物和探針序列資料采集自GenBank序列數據庫。

1.4反應體系組成

PCR反應總體積是50ul，含有10ul的5×Buffer.引物和對應的熒光標記探針各10 pmol，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 umol/L，Taq聚合酶SU，取抽提的血清DNA模板5ul，加入PCR反應管中。擴增反應在PE7700自動熒光定量PCR儀上進行。結果采用專用的分析軟件包SequenceDetection System software(version l.6.3)進行分析( Perkin-Elmer AppliedBiosystems)。PCR反應條件：開始95℃10 min，93℃45 s，55℃1 min，10個循環；然后95℃30 s，55℃45 s，30個循環。

1.5對照的選擇

每批PCR反應用克隆合成的EBV DNA-W片段作為陽性對照，并稀釋成不同濃度梯度(1×107、1×106、1×105、lx 104、1×103、1×102、1×10 copies/ul)進行PCR反應。

1.6血清中EBV DNA含量計算

血清EBV DNA拷貝數C=Qx( Vdna／Vpcr)×(l/ Vext)，其中C為血清中待測DNA拷貝數( copies/ml)，Q為PCR擴增后計算機檢測的原始DNA拷貝數，Vdna為抽提的DNA稀釋液體積，VPCR為用于PCR擴增的DNA體積，Vext用于抽提DNA的血清體積。

1.7統計學分析

兩組間EBV DNA拷貝數比較采用非參數樣本Mann-Whitney rank-sum檢驗，兩組間EBV DNA陽性率比較采用卡方檢驗。

2結果

2.1定量標準曲線的建立

用稀釋成不同濃度的EBV DNA陽性對照在PE7700型擴增儀上進行擴增反應。在PCR反應過程中，每8s實時檢測一次產物量，反應結束時得出PCR擴增的動力學曲線（見圖IA）及熒光定量PCR定量標準曲線(見圖IB)。

圖IA

圖IB

Fig. IDetection of EBV DNA by real time quantitative PCR.

(A)plot corresponds to a particular input target quantity marked by a corresponding symbol. The X axis denotes the cycle number of a quantitative PCR

reaction. The Y axis denotes the △Rn. which is the fluorescence intensity over the background.(B) plot of the threshold cycle (Ct) against the input

target quantity (common log scale). The input target quantity was expressed as copies of EBV DNA.

2.2血培養陰性Sepsis患者血清EBV DNA含量變化

20例血培養陰性Sepsis患者血清EBVDNA的檢出率為30%，中位拷貝數為2 650 copies/ml(0 -5 900 000 copies/ml).

2.3正常對照組血清EBV DNA含量變化

20例正常對照組中有0例血清中檢測到EBV DNA 0%，EBV DNA中位拷貝數為0 copy/ml(0 - 71 000 copies/ml)。

2.4血培養陰性Sepsis患者和正常對照組血清EBV DNA含量比較

血培養陰性Sepsis患者血清EBV DNA檢出率為30%，明顯高于正常對照組血清EBV DNA檢出率0%(P<0. 001. Chi-square Test)。Sepsis血培養陰性患者血清EBV DNA的拷貝數(中位數2 650 copies/ml)明顯高于正常對照組（中位數0 copy/ml)，兩組差異有統計學意義(P<0.001，Mann-Whitney rank-sum test)。

3討論

目前，膿毒癥的病死率高達30 %～50 % ，一旦并發休克和多器官衰竭，其病死率可達80 %～90 %。膿毒癥的級聯式炎性反應、凝血功能激活和纖溶功能受損最終可導致微循環障礙、多器官損傷和死亡[3]。在膿毒癥的處理中常見的問題有:未能盡早發現重癥患者、擴容不足、抗生素的使用太晚或劑量不足、心功能保護不當、血糖控制不當、急性肺損傷時未能使用低潮氣量和低氣壓通氣，在頑固性休克時未能有效治療腎功能不全[4]。

血培養陽性是診斷Sepsis的重要證據之一。但是血培養陰性的病例在臨床上也比較多見， 通過對本次研究的20例血培養陰性的Sepsis患者的病史調查發現，血培養陰性容易對該疾病的診斷產生延誤，有研究表明：血培養陰性Sepsis患者的臨床表現(如發熱、惡心、嘔吐、脈快、頭痛，嗜睡，脫水，酸中毒)較血培養陽性的Sepsis患者低[5，6]。因此在血培養陰性的病例中及時找出病因顯得尤為重要。病毒血癥在我國比較常見，其早期癥狀和Sepsis患者比較相似，容易混淆[7]。其中以HBV隱性感染為甚，因此血培養陰性的Sepsis患者很可能與多種病毒感染相關。EB病毒是一種人類皰疹病毒，基因組為雙鏈DNA。世界上90%人群成年前均感染過EBV大多數正常人攜帶EBV，這種原處于靜止狀態的病毒一旦處于活化狀態，即可變為與包括腫瘤在內很多疾病相關的病因。其中EBV-DNA檢測在血培養陰性的Sepsis患者有一定的表達，血培養陰性患者中可能EBV感染并導致病毒血癥。 Real-time定量PCR技術是運用熒光探針、通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中的熒光信號變化，反映PCR擴增動力學變化，實現實時定量檢測，具有快速、準確、不易被污染等優點。

本研究應用熒光定量PCR分析血培養陰性膿毒血癥血清中EBV DNA含量，發現30%的血培養陰性膿毒血癥患者血清可以檢出EBV DNA，而正常對照組患者僅0%可以檢測出EBV DNA。血培養陰性膿毒血癥組患者血清EBV DNA含量（中位數2 650 copies/ml），顯著高于正常對照組患者的EBV DNA含量(中位數0 copy/ml)。提示血培養陰性Sepsis患者血清EBV DNA含量明顯升高，對治療后隨診膿毒血癥患者血清EBV DNA進行定量檢測有助于監測患者的預后[8，9]。

參考文獻：

[1]Rickinson A B ， Kieff E.Epstein-Barr virus [M]//KnipeD M，Howley P M. Fields Virology.Philadelphia:Lippin-cott/WilliamsWilkins ，200 I : 25 7 5 -2627 .

[2]Alazard N.Gruffat H.Hiriart E.et al.Differential hyper-acetylation of histones H3 and H4 upon promoter-specific re-cruitment of EBWA2inEpstein - Barr viruschromatin [J].J Virol. 2003，77(14):8166-8172.

[3]Kieff E.Epstein-Barr virus and its replication [M] //FieldsB N，Knipe D M，Howly P M.Fields Virology.Philade-phia: Lippincott - Raven，1996:2397-2446 .

[4]Takakuwa T，Luo W J，Ham M F，et al.Integration of Epstein -Barr virus into chromosome 6 ql 5 0f Burkitt lympho-ma cell line (Raji) induce loss of BACH2 expression[J].Am J Pathol. 2004，164 (3):967-974.

[5]Delecluse H J.Bartnizke S，Hammerschmidt W，et al. Epi-somal and integrated copies of Epstein-Barr virus coexist in Burkitt lymphoma cell lines [J].J Virol，1993.67(3):1292-1299.

[6]Daibata M，Taguchi T，Nemoto Y，et al. Epstein - Barr virus(EBV)-positive pyothorax-associated lymphoma (PAL): chromoso-

mal integration of EBV in a novel CD2 -positive PALB-cell line [J].Br J Haematol， 2002， 117(3 ):546-557.

[7]Chang Y，Cheng S D，Tsai C H. Chromosomal integration ofEpstein-Barr virus genomes in nasopharyngeal carcinomacells [J]. Head Neck，2002，24(2):143-150.

[8]Lestou V S，De Braekeleer M.StrehlS，et al. Non-ran-dom integration of Epstein-Barr virus in lymphoblastoid celllines [J].C.en Chrom Cancer . 1993，8(I) :38 -48.

[9]Luo W J，Takakuwa'r，Ham M F，et al. Epstein-Barr virus is integrated between REL and BCL-IIA in AmericanBurkitt lymphoma cell line (NAB-2) [J].Lab Invest.2004，84 (9):1193-1199.