淺談動物細胞培養工藝中的監測與控制技術

在細胞培養的過程中，隨著細胞的增殖、底物的消耗及產物的生成，整個培養系統的狀態一直在產生變化。而各種狀態變量都有其限制范圍，當超出其界限值時就會對培養過程產生消極的影響，降低培養效率。因此在動物細胞的培養工藝中，利用過程監測與控制技術使培養系統保持在最佳的狀態也是整個工藝中重要的一環。

過程監測是指應用各種檢測技術對培養過程中狀態變量的變化進行追蹤的行為。當這些變量與預測值或與預期變化方式相偏離時，通過過程監測的手段便可以及早發現并開始利用已設定的模型計算如何改變培養狀態以及時補償這種偏離。而過程控制則利用過程監測所提供的信息按照暨定方案進行調整，以使培養過程向更好的方向發展。

一、在線測量

大規模動物細胞培養中由于大量細胞的代謝，細胞培養環境迅速改變，在線過程監控更為重要。離線取樣測定特別是產物濃度測定往往需要一天的時間，因此這種測定結果，不能用來及時指導生物反應器有關參數的控制和細胞培養環境的優化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費用。因此在線測定生物反應器中培養條件、代謝產物和目的產物濃度等大量數據，并對測定結果進行分析處理，及時對培養系統進行反饋控制是成功進行大規模動物細胞培養的需要。

在培養過程中對于過程監測與控制具有重要意義同時又可在線測量的參數主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業上應用生物反應器進行動物細胞培養時，這些參數都是被在線測量的對象。溫度與PH值這兩個參數對于細胞而言是最基本的影響因素，而在控制時往往與其它參數相獨立。溫度的測量通常在生物反應器內部單一位置，采用熱敏電阻檢測器（如Pt100熱電阻）進行。PH值則多用復合式玻璃電極測量。Clark復膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測元件。所有此類檢測元件都已成為生物反應器的標準配置。

攪拌轉速的檢測一般是通過應用磁感應式，光感應式或測速發電機來實現的。磁感應式和光感應式檢測器是通過計測脈沖數來測量轉速的。安裝在攪拌軸或電機軸上的切片切割磁場或光束而產生脈沖電訊號，則脈沖頻率就反映了攪拌轉速的大小。而測速發電機是安裝在攪拌軸或電機軸上的小型發電機，它的輸出電壓和轉速間有良好的線性關系。

補料速率直接影響到培養基中營養物質的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時間來計算，而泵的單位流量需在培養開始前用補料管道進行實際校準。如果不斷對補料瓶內的剩余體積進行監測，則可以得到足夠精確的補料數據來計算其他參數。

對于通氣流量測定有多種不同的方法。根據作用原理，流量計可分成兩大類型：體積流量型和質量流量型。體積流量型是根據流體動能的轉換以及流體流動類型的改變而設計的測量裝置。它會引起流體能量的不同程度的損失，而且測量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計和轉子流量計。質量流量型是根據流體的固有性質，如質量、導電性、電磁感應性、離子化、熱傳導性能等進行設計的流量計。如利用熱傳導性能對空氣進行測量時沒有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對尾氣中O2與CO2濃度的測量上可以利用質譜儀進行，但實際生產與實驗中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進行測定。

二、狀態估計

過程變量估計問題大致可以分為兩類：狀態估計和參數估計，所謂狀態變量即是指表示系統動態過程的性態所需的一組最少數目的變量，它是描述過程內在本質的，不一定是物理上可測的變量；而參數一般即指數學模型方程中待定的未知系數。狀態和參數的基本區別在于前者隨時間變化，而后者隨時間保持不變或緩慢變化。

對細胞培養過程所處的狀態進行分析時，最直接的方法就是通過在線測量獲得數據，再將其代入已有的過程模型中，從而得到關鍵狀態變量（如細胞密度、代謝速率、產物濃度等）的估計值。細胞在培養過程中，對環境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態估計所用的模型參數也處于不斷變化之中。故而狀態估計的問題就在于如何從一個運行中的培養系統內不斷獲得必需狀態參數的修正值，從而利用在線測得的直接數據正確地分析培養過程所處的狀態。用于狀態估計的技術按照其性質及在實踐中的應用可分為許多類型。

三、過程控制的基本類型

控制系統在對培養參數進行調整時可以采用許多模式。總體上可分為開環（open-loop）控制系統與閉環（close-loop）控制系統。

（一）開環控制系統

若系統的控制器與被控對象之間只有順向作用，沒有反向作用，即系統的輸出量對控制作用沒有影響，則稱該系統為開環控制系統。以細胞培養過程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規參數（溫度、攪拌、DO、pH等）穩定的同時，通過已建立的數學模型預測某一時間點細胞的生長代謝狀態，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養基補加策略及成分調整的依據，在細胞狀態發生改變之前做出調整。在這方面，關于雜交瘤生長和單抗生成的多種數學模型已經建立。系統化、結構化的補料策略也有了相當的發展，但由于這種模式要求對細胞生長和代謝的每一個細節都很清楚，在目前對生物體復雜的內在機理認識不足的情況下，理論預測與培養實踐仍有很大差距，這使得理論模型應用于實際生產受到了很大限制。

（二）閉環控制系統

系統的輸出量或狀態變量對控制作用有直接影響的系統稱為閉環控制系統。閉環模式相對于開環模式主要的區別是不需要建立模型去預測細胞和微環境將來的變化，而是通過在線（on-line）和/或離線（off-line）檢測手段獲得狀態數據，由人工或控制軟件根據當前值的變化即時調整培養設定參數，使培養系統始終處于最佳狀態。這種模式是在細胞狀態發生改變之后做出調整，也稱為反饋控制模式。細胞培養過程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環模式進行的。同時由于控制的目的是減小實測值與設定值間的差距，因此屬于負反饋控制。

（三）PID（proportional integral derivative）控制模型

在培養實踐中，一些狀態變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點上就可以滿足要求，則其控制采用“三點控制模式”即可。具體控制過程是首先以設定點為基準設置上、下限，當溫度高于/低于設定上限時啟動/關閉冷卻系統，當溫度低于/高于設定下限時啟動/關閉加熱系統，如此使溫度保持恒定。但在對更多的狀態變量（如PH，補料速率）進行閉環控制時采用這種簡單的方法會導致狀態變量不斷地圍繞設定值波動，對細胞的生長與代謝產生不良影響。

參考文獻：

[1]林福玉，陳紹烈，劉紅等.大規模動物細胞培養的問題及對策.生物技術通報，2009，7（1）：32-35

[2]胡顯文，李佐虎，陳建新等.氣液雙升式反應器動物細胞培養及批式生長動力學模型.生物技術通訊，2008，10（2）：104-108.