不同年齡健康人群腸道微生態(tài)的變化

【文章編號(hào)】1004-7484（2014）01-0102-02

在人體，腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，目前在腸道中細(xì)菌已知多達(dá) 500 余種，大約1013～1014個(gè)，厭氧菌約占98%以上。腸道菌群的種類和數(shù)量是相對(duì)穩(wěn)定的， 受飲食、內(nèi)分泌、衛(wèi)生習(xí)慣、地理環(huán)境、年齡及衛(wèi)生條件的影響而變動(dòng)。本研究以不同年齡階段的健康人群為對(duì)象，通過(guò)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)及熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)其腸道菌群的數(shù)量，進(jìn)一步研究腸道眾多菌群與年齡關(guān)系，希望找到長(zhǎng)壽老人相關(guān)腸道菌群。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

共收集健康人群糞便標(biāo)本81例，其中：少年組26例，男性16例，女性10例，年齡范圍8-15歲，平均年齡12.3歲；青壯年人群30例，男性17例，女性13例，年齡范圍27-50歲，平均年齡36.7歲； 老年人群25例，男性15例，女性10例，年齡范圍65-80歲，平均年齡71.2歲。三組人群采樣前無(wú)腹瀉便秘等胃腸道疾病、肝膽疾病及心腦腎等重要臟器疾病史，4周內(nèi)未用過(guò)微生態(tài)活菌制劑（如酸奶）及抗生素。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)者留取糞便標(biāo)本于無(wú)菌袋中，置入?yún)捬豕迌?nèi)，立即送檢分離，所需時(shí)間嚴(yán)格控制在30min之內(nèi)。

1.2.2目的菌群定性、定量檢測(cè)方法

常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)：無(wú)菌獲取新鮮糞便1g，置稀釋液A內(nèi)，振蕩器制勻漿，依次連續(xù)10倍稀釋到10-8，于不同稀釋度取標(biāo)本液50uL并用“L”棒涂抹于不同培養(yǎng)基上，依據(jù)研究目的，對(duì)所選目的菌進(jìn)行定性定量檢測(cè)。

非選擇性培養(yǎng)基：腸道厭氧菌培養(yǎng)基BL、腸道需氧菌培養(yǎng)基；

選擇性培養(yǎng)基：雙歧桿菌培養(yǎng)基、類桿菌培養(yǎng)基、乳桿菌培養(yǎng)基、腸桿菌培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基。

培養(yǎng)條件：厭氧菌培養(yǎng)采用厭氧盒，于37℃培養(yǎng)48 h～72 h；需氧菌用普通溫箱37℃培養(yǎng)48h。

菌種鑒定：厭氧菌三級(jí)鑒定法。采用API生化鑒定系統(tǒng)，將細(xì)菌鑒定到屬水平。檢測(cè)下限為2×10-1 CFU/g濕便。

熒光定量PCR：糞便總DNA抽提：采用QIAamp? DNA糞便袖珍試劑盒（Qiagen， Hilden， German）抽提糞便總DNA，按試劑盒說(shuō)明操作。所有抽提獲得的糞便總DNA置于-80℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增：采用相應(yīng)特異性引物，在不同條件下擴(kuò)增腸桿菌、乳酸桿菌、類桿菌以及雙歧桿菌（4種菌屬）DNA。定量PCR儀檢測(cè)：采用MJ Opticon 2定量PCR儀（Bio-Rad， USA）及MJ Opticon MonitorTM分析軟件（Version 3.1）分析糞便中細(xì)菌基因拷貝數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，兩組比較采用成組的檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均用SPSS10.0進(jìn)行處理。

2結(jié)果

2.1 糞便細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1少年組、靑壯年組、老年組三組腸道菌群值及B/E值比較

老年組腸桿菌較少年組及靑壯年組明顯增加（8.51±0.99VS 9.57±1.11 p<0.05；8.29±1.09 VS 9.57±1.11 p<0.01），少年組及青壯年組之間對(duì)比無(wú)差異；腸球菌及類桿菌菌群值與少年組及靑壯年組對(duì)比有增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析明顯差異；雙歧桿菌及雙歧桿菌與腸桿菌的比值（B/E值）老年組則明顯降低，見表 1。

3討論

腸道微生態(tài)與人的壽命、 健康密切相關(guān)。微生態(tài)平衡時(shí)，腸內(nèi)細(xì)菌就有益于人體，而在微生態(tài)失衡時(shí)，有害菌產(chǎn)生的毒性物質(zhì)或內(nèi)毒素的釋放，以及腸內(nèi)細(xì)菌導(dǎo)致的內(nèi)源性感染等又會(huì)引發(fā)疾病的產(chǎn)生， 加速衰老和死亡。老年人正常微生物種類與數(shù)量的改變與疾病的發(fā)生、 發(fā)展之間存在著非常微妙的關(guān)系。體腸道是一個(gè)巨大的細(xì)菌庫(kù)， 人的胃腸道棲息著大約30 屬550 多種細(xì)菌， 主要由厭氧菌 兼性厭氧菌和需氧菌組成， 其中專性厭氧菌占99%以上， 而僅擬桿菌及雙歧桿菌就占細(xì)菌總數(shù)90%以上[1]，沿著胃腸道，腸道微生態(tài)的分布不同[2- 3]。人體腸道正常菌群在腸腔內(nèi)形成3個(gè)生物層：深層近黏膜為膜菌群，由雙歧桿菌和乳酸桿菌組成，屬共生菌；中層為厭氧菌，包括消化鏈球菌、優(yōu)桿菌等； 表層為腔菌群，主要是大腸桿菌、腸球菌等需氧和兼性厭氧菌。它們以一定的數(shù)量和比例，存在人體的腸道中，起營(yíng)養(yǎng)、生物拮抗、免疫、 促進(jìn)生長(zhǎng)、抗腫瘤和防止衰老的作用[4]。雙歧桿菌通過(guò)利用短鏈糖類物質(zhì)而大量繁殖，形成競(jìng)爭(zhēng)的微生態(tài)環(huán)境，從而抑制致病菌的生長(zhǎng)，乳桿菌則是通過(guò)產(chǎn)酸降低腸道的pH值，從而達(dá)到形成不利有害菌生長(zhǎng)的酸性環(huán)境，它們已是公認(rèn)的腸道益生菌，與宿主終生相伴。菌群失調(diào)是指腸道原籍菌發(fā)生定性或定量的改變，出現(xiàn)益生菌與致病菌比例明顯改變。雙歧菌與腸桿菌的比值（B/E 值）可以用來(lái)作為腸道定植抗力的指標(biāo)，腸道定植力即指包括雙岐桿菌在內(nèi)的專屬厭氧菌對(duì)腸道需氧的潛在致病菌群的抑制作用，其比值小于1 表示腸道定植抗力受損[5] 。通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)老年組雙歧桿菌值較少年組及青壯年組明顯減少，（9.25±0.86 vs 8.56±0.89 p<0.05； 9.44±0.72 vs 8.56±0.89 p<0.01 ）見表1；熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)老年組乳酸桿菌值較青壯年組下降（6.95±0.53vs 7.65±0.26 p<0.05），見表2，而傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)兩者見無(wú)差異，見表1。我們同時(shí)對(duì)各組間的B/E值進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本組老年組的B/E值小于1，與少年組及青壯年組對(duì)比明顯下降，經(jīng)對(duì)比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.89±0.13vs1.09±0.15 p<0.01；0.89±0.13vs1.14±0.20 p<0.01，以上均說(shuō)明性老年人的腸道生物屏障功能減弱，定植抗力下降， 易發(fā)生腸道菌群的失調(diào)。

腸球菌及腸球菌是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，腸道受到外界影響處于病理狀態(tài)或用藥不合理的情況下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，是院?nèi)感染的重要病原菌，此次研究我們發(fā)現(xiàn)老年組無(wú)論腸桿菌還是腸球菌值較少年組及青壯年組均增加，特別是腸桿菌，增加明顯（9.57±1.11vs8.51±0.99 p<0.05； 9.57±1.11vs8.29±1.09 p<0.01 ）。提示在同樣的外界刺激下，老年更容易致病。

綜上所述，隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道腸桿菌、腸球菌的菌數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量顯著減少，B/E 值下降，腸道微生態(tài)出現(xiàn)演替性變化，腸道定植抗力減弱，抵抗病原菌侵襲能力降低，易于引起感染。下一步我們將繼續(xù)就如何調(diào)節(jié)老年人腸道微生態(tài)，保護(hù)腸粘膜展開研究。

參考文獻(xiàn)：

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