5—脂氧合酶抑制劑治療Jurkat細胞移植瘤裸鼠的實驗研究

【摘 要】目的：觀察5-脂氧合酶抑制劑NDGA（去甲二氫愈創木酸）對急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞系Jurkat細胞在裸鼠體內生長的影響。方法：選用Jurkat細胞裸鼠體內接種成瘤后，腹腔注射給藥觀察其對腫瘤生長的影響。Western檢測細胞細胞周期蛋白p-ERK，Bcl-2/Bax的變化。結果：NDGA能抑制腫瘤的生長（P<0.01），使Jurkat細胞凋亡增加（P<0.05）。Jurkat細胞p-ERK，Bcl-2/Bax表達明顯下調 （P<0.05）。結論：NDGA能抑制Jurkat細胞移植瘤的生長，促進Jurkat細胞的凋亡。其作用機制與p-ERK，Bcl-2/Bax表達明顯下調有關。

【關健詞】急性淋巴細胞白血病；裸鼠；凋亡；p-ERK；Bcl-2；Bax

【中圖分類號】R-33 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）01-0042-02

急性淋巴細胞白血病（ALL）是一種較為常見的血液系統疾病之一。ALL約占占兒童白血病的75%，且近年來白血病的發病率呈逐年上升趨勢，每年新增病例約9000人（兒童和成人）[1]。因此，尋找行之有效的化療藥物具有十分重大的意義。去甲二氫愈創木酸 （NDGA）是常青黎科灌木Larrea tridentate中提取的一種抑制白三烯等代謝產物生成的脂氧合酶抑制劑，近年來國內外研究表明其對部分腫瘤也有抑制作用[2]，但尚未見其對人白血病細胞系作用的報道。本文旨在研究NDGA對人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞裸鼠移植瘤生長的影響來探討其抗腫瘤活性的機制，為其臨床應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養基購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司。裸鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所，在SPF級動物合格環境下飼養。NDGA 購自Calbiochem公司。β-actin，p-ERK，Bcl-2和Bax抗體均購自Santa Cruz。辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG（二抗）和堿性磷酸酶顯色試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和藥物處理

Jurkat細胞接種于含10%胎牛血清體積分數的RPMI 1640培養液 （pH值7.2-7.4，含100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）。于37℃，5%CO2，飽和濕度的恒溫培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 裸鼠實驗模型的建立及處理

所有實驗裸鼠接種腫瘤前給予400cGy137Cs γ射線全身照射。取對數生長期的Jurkat細胞，用不含血清的RPMI 1640基礎培養液洗滌細胞2次，重懸于RPMI 1640培養基，細胞濃度為5×107細胞/mL。充分混勻后取200 μ1細胞混懸，皮下接種于裸鼠的右背側。游標卡尺測量腫瘤大小，接種Jurkat細胞10天后挑選成瘤小鼠做為第（3）步實驗對象，隨機分三組，每組5只小鼠：A組（對照組）、B組（生理鹽水組）、C組（NDGA組），NDGA組腹腔給予NDGA（10μM，0.1ml/10g，1/5d）處理，生理鹽水組組腹腔給予同等量生理鹽水。腫瘤體積的計算公式為π/6（Wl×W2×W 2），其中W1代表長徑，W2代表短徑。實驗結束后拉頸處死小鼠后，迅速分離瘤組織，分為2部分：一部分放進0.1 %DEPC處理的細胞凍存管中，立即放進液氮，備提蛋白；另一部分用10%中性甲醛固定24h，常規石蠟包埋，切片，作TUNEL檢測。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞

各組小鼠腫瘤細胞凋亡率的檢測依照TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒說明步驟進行。結果的判定以細胞核著棕黃色者為陽性細胞。每個標本觀察一張切片，隨機選取5個高倍視野計數100個細胞。凋亡細胞陽性指數（AI）的計算按以下公式進行，AI=（凋亡陽性細胞數/總計細胞數）×100%。

1.2.4 Western蛋白印跡法檢測NDGA對Jurkat細胞p-ERK，Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

取對各組小鼠腫瘤組織提取細胞總蛋白。總蛋白濃度經Bio-Rad測定，SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，熒光顯色，沖洗。掃描蛋白印跡膠片后觀察結果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統（4.02版本）分析條帶影像。

1.3統計學分析

數據應用SAS 6.12和SPSS 13.0統計軟件進行處理， 腫瘤生長情況采用兩因素方差分析，western結果采用單因素方差分析。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 NDGA對Jurkat細胞移植瘤生長的影響

結果顯示NDGA對Jurkat細胞移植瘤生長具有顯著抑制作用，與對照組和生理鹽水組相比，實驗組腫瘤生長明顯變慢，不同組間腫瘤體積有顯著性差異（F=23.975，P<0.01）（圖1）。

2.2 NDGA對Jurkat細胞凋亡的影響

TUNEL結果顯示NDGA對Jurkat細胞移植瘤具有明顯的凋亡誘導作用。實驗細胞凋亡率為13.45±4.86，與對照組的2.97±1.53和生理鹽水組的3.2±2.42相比，不同組間細胞凋亡率有顯著性差異（F=10.12，P<0.05）（圖1）。

2.3 NDGA對Jurkat細胞p-ERK，Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

經NDGA作用后Jurkat細胞移植瘤組織p-ERK蛋白表達降低至0.31±0.08，與對照組和生理鹽水組的0.64±0.12和0.59±0.11比較，差異有統計學意義（F=9.979，P<0.05）；Bcl-2蛋白表達降低至0.22±0.1，與對照組和生理鹽水組的0.51±0.1和0.48±0.13比較，差異有統計學意義（F=6.007，P<0.05）；Bax蛋白表達增高至0.39±0.11，與對照組和生理鹽水組的0.1±0.08和0.09±0.08比較，差異有統計學意義（F=10.665，P<0.05）；

3 討論

急性淋巴細胞白血病是兒童白血病主要類型之一，近年來其發病率呈逐年上升趨勢。雖然近年來急性淋巴細胞白血病的診斷和治療手段有了很大的提高，但是仍有高達20%的ALL患者出現白血病復發，因此，尋找新的治療急性淋巴細胞白血病的化療藥物具有重要意義。5-脂氧合酶（5-LOX）是脂氧合酶同工酶中的一種，是機體內催化花生四烯酸生成生物活性分子白三烯的關鍵酶[3]。傳統認為5-LOX主要來源于白細胞、肥大細胞和巨噬細胞，通過誘發炎癥、增強白細胞和巨噬細胞的趨化而參與哮喘、類風濕性關節炎等病理生理過程。近年來隨著研究的深入，人們在腫瘤細胞、神經元、平滑肌細胞等多種組織細胞中也發現5-LOX表達，表明它在腫瘤發生、發展等多種病理生理過程中都發揮著重要的作用[4]。NDGA是一種廣譜脂氧合酶抑制劑，它能夠抑制5-LOX的活性。本研究證實NDGA對Jurkat細胞裸鼠移植瘤生長的有顯著的生長抑制作用，與上述報道有一定的相似性。

細胞凋亡作為一種有別于壞死的細胞死亡方式，是一種基因控制的主動的、受多種基因調控、自發生、多種酶參與的復雜過程，目的為維護細胞內環境穩定，在腫瘤的發生發展過程中起著重要的作用。誘導腫瘤細胞的凋亡一直是腫瘤研究的熱點[5]。為此本實驗觀察了NDGA對急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡的影響：流式細胞儀可發現NDGA作用后急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞的凋亡率高于對照組，成時間依賴性上升，表明NDGA可有效地誘導急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞的凋亡。

腫瘤細胞的凋亡與腫瘤的發生發展及對化療和放療的抵抗密切相關。在細胞凋亡的調控過程中涉及眾多信號分子，其中Bcl-2家族是凋亡信號調節中最重要的基因家族之一，起著至關重要的作用。Bcl-2家族成員按在細胞凋亡的調控過程中功能不同分為：抗凋亡和促凋亡兩大類，其中促凋亡蛋白的Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是研究最深的一對，二者相互拮抗，有研究表明Bcl-2/Bax比值的降低可以誘導腫瘤細胞的凋亡。NDGA作用于后可引起Bcl-2基因表達的下調，隨著時間的延長Bcl-2表達的下調作用更為顯著；而Bax基因表達隨著作用時間的延長成時間依賴性升高，提示NDGA誘導Jurkat細胞凋亡的作用是通過抑制凋亡抑制基因Bcl-2和促進凋亡促進蛋白Bax的表達來起作用的。

從本研究看NDGA能夠抑制人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞的生長，并能誘導腫瘤細胞的凋亡。從這一結論可以看出，NDGA可望成為臨床上治療急性淋巴細胞白血病的有效藥物，但其作用途徑和機制，尚需進一步研究。

參考文獻：

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