改良獸藥水針劑藥敏試驗方法

劉海林　荊汝頂

藥敏試驗在治療畜禽細菌性疾病中發揮著重要的作用，可以減少因盲目用藥造成的經濟損失。然而很多獸藥專用藥物的藥敏片在國內很難買到，且有些獸藥抗生素為復方制劑，直接購買的藥敏片不能滿足臨床試驗需要。經過長期實踐，探索出一種獸藥水針劑的簡易藥敏試驗方法。此方法操作簡單能直接反應商品化獸藥抗生素對分離細菌的敏感程度，現以大腸桿菌為例將該方法介紹如下。

1 設備及材料

1.1 儀器設備

立式高壓滅菌器，型號為LDZX-30KBS；生化培養箱，型號為250B；電熱恒溫培養箱，型號為DNP-9082BS-Ⅲ；超凈工作臺，型號為SW-CJ-1F型；進口10 μL移液器滴頭，生產廠家為AXYGEN公司；0.5-10 μL或0.1-2 μL移液器，芬蘭BIOHIT公司生產；游標卡尺或學生用尺，另外，鑷子、玻璃平皿、500 mL三角瓶、酒精燈、接種棒、醫用棉簽等購自當地醫療器械公司，6 mm打孔器購自當地文具店。

1.2材料

MHA、MHB瓊脂北京陸橋科技有限公司生產，新華一號濾紙，去離子水或蒸餾水為本單位自制，待檢菌株自備。

2 方法

2.1 培養基的制備

MH肉湯（MHB）制備：稱取MHB原粉2.5 g，用100 mL蒸餾水進行溶解并測定pH值，若pH值不在要求的7.2-7.4范圍內，應當用HCl或NaOH進行調節。調節好pH值的MHB放到高壓滅菌器內121℃高壓15 min備用。

MH瓊脂（MHA）制備：根據培養基說明稱取7.6 gMHA瓊脂粉，用200 mL蒸餾水進行稀釋，充分溶解后調節pH 值，然后121℃高壓15 min。待培養基冷卻到50℃左右時倒入滅菌平皿中，平皿中瓊脂的厚度在4～5 mm為宜，冷卻后的培養基平板要隨機進行無菌抽檢，抽檢合格的瓊脂板放到冰箱2～8℃保存，盡量在一周內用完。

2.2 受試菌的制備

將臨床分離好的致病菌用MH肉湯進行增菌培養，然后將增菌后的菌液用生理鹽水或MH肉湯稀釋到0.5麥氏比濁管濁度，備用。

2.3 臨床獸藥水針抗生素準備

目前臨床上應用的獸藥水針抗生素用量上一般為0.05～0.2 mL/（kg·bw），試驗前將用量不同的水針用蒸餾水（或規定的稀釋液）進行稀釋，統一到相同用量，如：都轉換為0.1 mL/（kg·bw）。然后將統一過用量的藥物裝到干凈滅菌的青霉素小瓶中，貼上制備時間等必要的記錄備用。

2.4 藥敏試驗用紙片制備

用6 mm打孔器將新華一號濾紙打成圓形小紙片，然后裝于容器中高壓滅菌后烘干備用。

2.5 改良紙片法操作步驟

2.5.1 用滅菌棉簽浸入到調整好比濁度的菌液中，將棉簽在容器壁上旋轉幾次，除去多余的液體，然后取MHA瓊脂板，用棉簽在瓊脂上劃線均勻涂布，每次旋轉60度，整個平板反復涂擦2次以上，最后用棉簽沿瓊脂邊緣涂抹一圈。如果水分過多可以打開蓋子3～5 min，以便在放置藥敏片之前晾干表面水分。

2.5.2 將滅菌烘干的濾紙片表面用永久性記號筆標上數字編號，每個帶有數字的紙片對應一種待檢水針藥物，然后把各紙片均勻放置在平皿上，每兩個紙片的距離在20 mm以上為宜。

2.5.3 用0.1～2 μL移液器吸取準備好的各種水針藥物1 μL并滴加到對應編號的紙片圓心位置。所有藥物滴加完畢后，蓋好平皿靜置3～5 min，使各種液體藥物在紙片上均勻擴散開。

2.5.4 然后將平皿倒扣放置于35±2℃的恒溫培養箱中孵育8 h以上，最好孵育16～18 h。

2.5.5結果判定

達到要求的培養時間后，檢查接種細菌生長是否良好，如果生長良好會有融合生長的菌苔出現，藥敏片周圍會出現無細菌生長的圓圈。如果平板上出現的是單個的菌落，說明配制的菌液過稀或培養基營養成分不符合細菌生長要求，這種情況應當查找原因重新試驗。符合判讀要求的平板，用游標卡尺在瓊脂板背面量取各藥敏片的抑菌圈直徑，每個抑菌圈量取2次，取2次的平均值作為最終結果，將結果填寫到細菌藥敏試驗記錄表上，以便比較各種藥物敏感情況。

通過用標準菌株（大腸桿菌ATCC25922）多次試驗證明，成分及含量與包裝上標明的相符且用量在0.1～0.2 mL/（kg·bw）的獸藥水針，按照1～1.5 μL/片的含量進行試驗，結果可以參考CLSI規定的K-B紙片法判定標準進行判定。成分不明或復方制劑可以通過比較相同試驗條件下產生的抑菌圈大小來大概評估各種獸藥的抑菌效果。

3 結果

通過改良的水針劑藥敏試驗方法，可以直接的反映出商品化水針劑對分離細菌的敏感程度，篩選出敏感性抗生素進行有針對性的治療，大大提高了獸醫臨床上細菌病的治愈率。

4 討論

由于很多獸藥抗生素目前在國內沒有商品化的標準藥敏片（如：氟苯尼考、達氟沙星等），改良水針藥敏試驗可以直接利用水針劑藥物進行試驗，通過對不同藥物抑菌圈大小進行比較，而篩選出敏感性藥物，解決了因無藥敏片而無法試驗的問題。

該方法直接用水針劑進行試驗，篩選敏感藥物，省去了傳統方法先制作藥敏片的程序，節省時間。

目前獸藥市場比較混亂，部分獸藥抗生素實際成分與標明的不符，如果用購買的標準化的藥敏片進行試驗然后去篩選對應的獸藥很可能達不到預期的療效，本方法直接用商品化藥物進行試驗，篩選出來的藥物針對性更強，療效更顯著。

經過實踐證明，在選擇合適的培養基的條件下，該方法對于一些營養要求較高的苛性細菌進行藥敏試驗效果均很理想。

抗生素耐藥情況與當地使用抗生素的習慣有關，有一定的地域性差別，獸醫門診可以采用此方法很快評估出新購進的水針獸藥在當地的敏感情況，比采用臨床治療加回訪療效的評估的方法所需的時間短、見效快。（編輯：狄慧）