關于免疫膠體金技術靈敏度改善及定量檢測的研究

摘要：

潛血測定對惡性腫瘤的檢驗十分重要，而免疫膠體金技術是測潛血的重要方法，因其操作簡便、快速、靈敏等優點應用廣泛。本文就如何放大作用信號以提高此法的靈敏度及如何做到半定量、儀器定量檢測的問題提出了幾點建議。

關鍵詞：膠體金；免疫層析法；潛血；靈敏度；定量

【中圖分類號】

R749.053 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）06-0288-01

前言：

潛血測定是檢驗是否有惡性腫瘤及是否有炎癥、結石的重要方法[1]。膠體金免疫層析法測潛血因其具有單份檢測、簡單快速、特異靈敏、和可肉眼觀察結果等特點，成為當今最快速靈敏方便的免疫學檢測技術之一[2]。但膠體金技術仍存在一定劣勢，如存在帶現象，靈敏度有待提高，未能定量等[3]。關于此法靈敏度改善及定量測量的問題仍有很大研究空間。下文為理論研究后提出的幾個方案：

關于提高靈敏度

方案一：

先進工藝生產高質量膠體金顆粒，優化硝酸纖維素膜、樣品墊等。同時各種膜，甚至包括樣品墊要經過預期處理以減少非特異吸附[4]。

1.膠體金顆粒應大小、形狀盡量一致，更均勻。同時找出最合適的顆粒半徑。以此提高靈敏度，特異性和穩定性。

1.1 顆粒如果不均勻，在標記時表面將不能均勻包被蛋白質，在溶液中的分布也會不均勻，成品的顏色、靈敏度、特異性和穩定性就會受到影響。不均一的顆粒形狀和大小會產生很不均勻的蛋白質包被，會導致金標存放時出現結塊和聚合，在干燥過程中，顆粒形狀的不規則導致其不能與蛋白質緊密結合，使得表面蛋白質很容易與膠體金分離，產生假陰性和深背景。另一個問題因為未完全包被的金顆粒直接暴露在墊上而不能釋放，這就意味著金表面的蛋白質或永遠吸附在基材上，或脫離金顆粒被沖走了，導致金標不能以正常速度并且完全地從金標墊上釋放。應研究先進生產工藝使得其瞬間形成晶核，使晶核更均勻，穩定。

1.2 顆粒越大，顆粒的積累越容易看到。空間位阻將成為一個很大的問題，使它們難和特異蛋白結合。另外，顆粒越大，一定體積溶液中所含的數量越少，所以需要找到最合適的顆粒半徑。

2. 選擇合適的醋酸纖維薄膜孔徑大小，并且做到孔徑均一性，盡可能減少檢測誤差[5]。

方案二：

引進信號放大系統，如生物素-鏈親和素系統。

親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，由4個亞單位組成，每個親和素能結合4個分子的生物素，親和素與生物素之間的親和力級強，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍，因此二者結合特異性高、穩定性好。生物素易與蛋白質以共價鍵結合，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，在起到了多級放大作用的同時，酶又在遇到相應底物時因催化作用而呈色，從而達到檢測未知抗原分子的目的。

將鏈親和素和抗人血紅蛋白（Hb1）單克隆抗體結合，作為薄膜上檢測區的捕捉物；將膠體金及其標記的抗人血紅蛋白（Hb2）單克隆抗體與生物素（BNHS）結合。應用鏈親和素與生物素結合的四價性及極高的親和常數，使攜帶分析物的膠體金復合物極易與檢測區上捕捉物結合，提高檢測靈敏度。

關于使用儀器定量檢測

方案一：

把設計成只能結合已知定量的分析物的反應劑做成檢測線，過量的分析物就會和下一條檢測線結合，產生一個溫度計式的條帶梯度。精確控制每條條帶一致性，通過大量實驗獲得顯色條代數與檢測物濃度之間的關系。根據顯色條帶的數目以及最后一條條帶顏色深淺即可達到半定量。

方案二：

光電比色法使用分光光度計測定所顯顏色強度

根據Lambert-Beers法則，當一束平行的單色光通過含有吸光物質的溶液時，溶液的吸光度（A） 與溶液的濃度 （C） 和吸收層厚度 （b） 的乘積成正比

A=εCb

將標準血紅蛋白溶液溶解于亞硝酸鈉和疊氮化鈉溶液中，氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白中的二價鐵離子會被亞硝酸鈉氧化成三價鐵離子，成為高鐵血紅蛋白。高鐵血紅蛋白和疊氮化鈉形成有顏色復合物。其最大波長為540nm。將所得復合物溶液稀釋一定倍數，用分光光度計在其最大波長測定其吸光度，得到一條該復合物吸光度關于濃度的標準曲線[6]。

將含有樣品的醋酸纖維薄膜按上述方法同樣測吸光度。即可從標準曲線上查得血紅蛋白濃度，即檢測出了所顯顏色強度。

小結

免疫膠體金技術出現以來發展十分迅速，應用也越來越廣泛，該技術經過多年的使用，顯示了眾多的優勢：操作簡單易行，無需特殊設備，無毒無污染等[7]。如果能提高此法靈敏度并且做到定量測量則又實現了一大步跨越。本文提出的一些改善靈敏度方法及定量方法僅基于理論研究，真正應用還需進一步的試驗。

參考文獻

[1] 膠體金技術在生物安全檢測中的應用.檢驗世界網[引用日期2012-12-9]

[2] 朱忠勇.實用醫學檢驗學.北京：人民軍醫出版社，1992. 87

[3] 李妍，寧云山，李明.膠體金免疫層析技術及其在瘧疾診斷中的應用[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊， 2004，25（5）：403

[4] 免疫膠體金測試原理.檢驗世界網[引用日期2012-010-11]

[5] 張惠娟. 對膠體金試紙法測定便隱血試驗的評價與比較[J]. 現代中西醫結合雜志， 2008 （23）.

[6] 王興國， 狄建設， 王磊， 等. 快速全血定量測定血紅蛋白在無償獻血中的應用[J]. 臨床輸血與檢驗， 2006， 8（2）： 139-139.

[7] 吳子安， 胡珺， 黃麗英， 等. 化學法與免疫膠體金法檢測糞潛血的比較[J]. 實用醫技雜志， 2006， 13（16）： 2801-2802.

[8] Lieberman DA.One—time screening for colorectal call—eer with combined fecal occult—blood testing[J].N Engl JMed，2001，345（8）：555