依替巴肽注射液細菌內毒素方法研究

摘要：

目的：對依替巴肽注射液的細菌內毒素檢查方法進行探討，建立其細菌內毒素檢查方法。方法：按《中國藥典2010》二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查方法進行。結果：在驗證條件下，依替巴肽注射液可以采用稀釋方法排除干擾。結論：可以采用此法對本品的細菌內毒素進行檢查。

關鍵詞：依替巴肽注射液；細菌內毒素方法；驗證

Research of Bacterial Endotoxin Method for Eptifibatide Injection

JIN Aimin， WANG Chunling， WANG Cuiling， LI Qin， HU Chunyong （Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu， 222000）

Abstract：

Objective： Research and establish bacterial endotoxin method for Eptifibatide Injection. Method： Test according to Appendix XI E test for bacterial endotoxin in the 2010 Edition of Chinese Pharmacopeia Volume II. Result： Under validation conditions， the dilution method can be used to eliminate the interference in the test of Eptifibatide Injection. Conclusion： This method can be used to test the bacterial endotoxin in Eptifibatide Injection.

Key words： Eptifibatide Injection， Bacterial Endotoxin Method， Validation

【中圖分類號】

R453 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）06-0047-02

急性冠脈綜合癥（Acute coronary syndromes，ACS）是血小板功能過度激活而產生的血栓性事件。根據臨床癥狀主要分為不穩定型心絞痛（Unstable angina pectoris，UAP）、非ST段抬高心梗死（Non-ST-elevation myocardial infarction，NSTEMI）及ST段抬高心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction，STEMI）[1-3]。冠狀動脈血管斑塊破裂或血管內皮被侵蝕而引起的血栓栓塞是促發ACS的主要原因，可發生于多個部位。由于ACS發病急，并且導致病情不穩定因素多，導致此病較難控制，現已成為嚴重影響人類生存質量的疾病之一[4]。依替巴肽為特異性GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，通過與血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受體結合，占據了其上的結合位點，使血小板GPⅡb/Ⅲa受體不能與纖維蛋白原結合，從而抑制了血小板聚集。由于依替巴肽阻滯了血小板聚集的最后共同途徑，具有抗血小板作用強、起效快、不良反應少等優點，因此對依替巴肽注射液的研究，可滿足國內急性冠脈綜合癥狀病人的需要，填補國內空白，具有較好的社會效益和經濟效益。無菌檢查、細菌內毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[5]，本品為注射劑按照中國藥典2010版附錄ⅠB[6]的要求，為了更加有效的保障患者用藥安全，本品要進行細菌內毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Ms3digital旋渦混合器，CJ-2F凈化工作臺，DK-600S電熱恒溫水槽，DMH-1電熱干燥箱。

1.1.2 試劑：鱟試劑1【規格0.06EU/ml（0.1ml/支）批號11080611】福州新北生化工業有限公司；鱟試劑2【規格0.06EU/ml（0.1ml/支）批號1110122】湛江海洋生物制品有限公司；鱟試驗用水【50ml/支批號11010305】福州新北生化工業有限公司；細菌內毒素工作標準品【規格180EU/支批號150601-200965】中國藥品生物制品檢定所；pH調節劑【規格2ml/支批號110904】福州新北生化工業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗準備：所有容器、用具都必須經過處理，去除外源性內毒素，玻璃儀器于250℃干烤至少1小時，塑料用具須確證不干擾實驗結果。操作過程中避免微生物污染。初次使用的鱟試劑必須經過靈敏度復核[7]。通過測評及計算依替巴肽注射液（100ml：75mg）的細菌內毒素限值暫定為L<0.5EU/mg。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復核： 按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核，二批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查λc與λ一致（應在0.5λ≤λc≤2λ范圍內），結果均符合規定。

1.2.3 依替巴肽注射液（10ml：20mg、100ml：75mg）對細菌內毒素檢查干擾試驗

1.2.3.1 干擾預試驗（鱟試劑：λ=0.06EU/ml）：取本品，加BET水進行供試品溶液（NPC）和供試品陽性對照溶液（PPC）的配制。

1.2.3.1.1 供試品溶液（NPC）配制：取三個批號的供試品（100ml：75mg），BET水及pH調節劑制備成38.mg/ml、18.75mg/ml、9.375mg/ml、6.25mg/ml共四個濃度。

1.2.3.1.2 細菌內毒素工作標準品溶液稀釋方法：用1ml的鱟試驗用水溶解1支細菌內毒素工作標準品，用旋渦混合器連續混合15分鐘，成150EU/ml，用鱟試驗用水稀釋成4λ、2λ，在進行下一步稀釋前，至少混和30秒。

1.2.3.1.3 供試品陽性對照溶液（PPC）的配制：配制的濃度同上，每個濃度中含2λ（0.125EU/ml）的細菌內毒素，制備成38.mg/ml+2λ、18.75mg/ml+2λ、9.375mg/ml+2λ、6.25mg/ml+2λ共四個濃度。

1.2.3.1.4 試驗過程： 取上述二個廠家的鱟試劑各64支，先分別加入0.1mlBET水溶解，再分別加入0.1ml供試品和供試品陽性各濃度稀釋液，混勻后，于37±1℃無振動保溫60± 2分鐘，同時設陰性和陽性對照，每個濃度平行做2管。

結果表明，依替巴肽注射液（100ml：75mg）在18.75mg/ml以下稀釋度時，對以上二個廠家的鱟試劑均未產生干擾作用。故18.75mg/ml稀釋度為最小不干擾稀釋倍數。根據依替巴肽注射液（100ml：75mg）的試驗結果，依替巴肽注射液（100ml：75mg）選取15mg/ml稀釋液作為細菌內毒素檢查的供試品溶液濃度。

1.2.3.2 供試品的干擾試驗：

為進一步確證供試品溶液對0.06EU/ml的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和供試品15mg/ml稀釋液進行實驗，將細菌內毒素工作標準品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內毒素溶液。

1.2.3.2.1 供試品15mg/ml稀釋液的制備： 取上述三個批號的供試品，分別用BET水稀釋成15mg/ml供試液。

1.2.3.2.2試驗過程（鱟試劑：λ=0.06EU/ml）：——用BET水與15mg/ml供試液分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml四個濃度，作為細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液。

——取上述二個廠家的鱟試劑各72支，每支分別用0.1mlBET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的細菌內毒素標準品溶液和細菌內毒素供試品溶液各0.1ml，每一濃度平行做4管，輕輕混勻。同時分別用0.1ml鱟試驗用水和供試品溶液做陰性對照，平行做兩管。垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準確記錄時間，在37±1℃無振動保溫60± 2分鐘。

表1 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干擾試驗預試驗

Table 1 Preliminary Test of Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）

注1：“NPC”為供試品溶液 “PPC”為供試品陽性對照溶液 “NC”為陰性對照 “PC”為陽性對照 “+”為凝固，“-”為未凝固。

1.2.3.2.3 試驗結果

表2 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干擾試驗

Table 2 Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml：75 mg）

注1：“+”為凝固，“-”為未凝固。

表2試驗結果表明，15mg/ml供試品稀釋液的供試品的Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認無干擾影響。當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗。[8]

2 結果

表3 依替巴肽注射液（100ml：75mg）細菌內毒素檢查

Table 3 Bacterial Endotoxin Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）

注1：“+”為凝固，“-”為未凝固。

3 討論

在本實驗條件下，取三個批號的供試品（100ml：75mg），用BET水分別按上述方法配制成15mg/ml供試品稀釋液（L<0.4EU/mg），然后用λ=0.06EU/ml的上述二個廠家的鱟試劑各16支實驗Et值均在0.5Es～2Es范圍之間，確認無干擾影響。依替巴肽注射液經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素檢查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢測結果準確可靠。

參考文獻

[1] Balasubramaniam K， Viswanathan G N， Marshall S M， Zaman A G. Increased Atherothrombotic Burden in Patients with Diabetes Mellitus and Acute Coronary Syndrome： A Review of Antiplatelet Therapy[J]. Cardiol Res Pract，2012， 2012：909154.

[2] Ferreiro J L， Angiolillo D J. Diabetes and antiplatelet therapy in acute coronary syndrome[J]. Circulation， 2011， 123（7）：798-813.

[3] Davi G， Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis[J]. N Engl J Med， 2007， 357（24）：2482-2494.

[4] Fuster V， Moreno P R， Fayad Z A， Corti R， Badimon J J. Atherothrombosis and high-risk plaque： part I： evolving concepts[J]. J Am CollCardiol， 2005， 46（6）： 937-954.

[5] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4：）46

[6] 國家藥典委員會編，中國藥典二部附錄，北京：中國醫藥科技出版社，2010：6

[7] 國家藥典委員會編，中國藥典二部附錄，北京：中國醫藥科技出版社，2010：100

[8] 國家藥典委員會編，中國藥典二部附錄，北京：中國醫藥科技出版社，2010：101