新型AT1受體拮抗劑的降壓活性研究

鄭慧玲 鮑曉璐 陳志龍

【摘要】目的 研究新型AT1受體拮抗劑的降壓活性。方法 利用放射性受體結合實驗和降壓實驗評價化合物對AT1受體親和力大小以及體內降壓活性。結果 與陽性對照氯沙坦相比，1號化合物有更好的AT1受體親和力。結論 1號化合物具有較好的降壓效果。

【關鍵詞】高血壓；細胞；新型AT1

高血壓是一種常見的心血管疾病，在人群中有相當高的致病率和死亡率。我國當前有1.6億高血壓患者，而且每年還以300萬人新發病遞增，每年因心腦血管合并癥而死亡的有260萬人，嚴重影響了人民的生命和健康。自從第一個血管緊張素II受體拮抗劑—氯沙坦在瑞典問世以來，人們對沙坦類藥物的作用機制、藥理作用、臨床效果的認識不斷更新，在心腦血管疾病的防治中應用越來越廣泛，而且越來越受到臨床上的重視。最新研究報告顯示，長期服用沙坦類藥物的高血壓患者，患癌癥的幾率遠低于不服用沙坦類藥物的人群，從而揭開了沙坦類藥物具有抗腫瘤作用的新篇章。

世界衛生組織（WHO）建議的血壓測量標準是：正常成人收縮壓應小于或等于140 mmHg（18.6kPa），舒張壓小于或等于90 mmHg（12kPa）。如果成人收縮壓大于或等于160 mmHg（21.3kPa），舒張壓大于或等于95 mmHg（12.6kPa）則為高血壓；血壓值在上述兩者之間，為臨界高血壓。全球高血壓的患病人數逐年增加，調查表明高血壓的發病年齡逐漸趨于年輕化。據2009年國際高血壓學會第21屆年會報道，目前全球大約有9.72億人患高血壓或血壓偏高，相當于成年人口的26.4%，發達國家高血壓患者有3.33億人，發展中國家有6.39億人。預計到2025年，這一數字將增加到15.6億。目前龐大的市場被國外產品壟斷，國內沙坦類降壓新藥的研發還需突破和發展。

血管緊張素II受體拮抗劑（沙坦類藥物）是一類特異性高、耐受性好、而且副作用小、安全可靠的新型抗高血壓藥物。本文以BMS-180560為先導化合物，通過構效分析、生物電子等排和結構拼合等藥物設計基本方法，設計合成了化合物1，并進行了活性評價。

關鍵詞：血管緊張素II 受體1，拮抗劑，高血壓，

1 實驗動物

雌性SHR（中國科學院斯萊科上海實驗動物中心）。

2 材料

2.1 材料與儀器

新型化合物：東華大學生物醫藥研究組；EP214C型電子分析天平： SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州凈化；SN—682型γ計數器：上海日環廠；上海一恒科學儀器有限公司； ZH-HX-Z無創尾動脈血壓測量分析系統：淮北正和生物公司；二氧化碳細胞培養箱：Thermo Scientific。

3 實驗方法

25I-Ang II溶液配制：取0.012g（12mg）125I-AngII，加1ml PBS溶解，得到濃度10-2M。

細胞鋪板：取血管平滑肌細胞3-7代鋪于24孔板中（1×107/孔），貼壁后用于試驗。

3.1 結合反應：每個濃度采用3個復孔。細胞板每孔依次加入濃度逐漸增加的125I-Ang II溶液，使其終濃度分別為0nM；0.02nM；0.04nM；0.08nM；0.16nM；0.32nM；0.64nM；1.5nM，為了扣除非特異性結合，每個濃度的第三個平行復孔加入未標記的Ang II（終濃度為1×10-6 M）和濃度遞增的125I-Ang II溶液，每孔的最終體積為1000μL（其中500μL為細胞培養液），4℃反應150 min，反應結束后去除多余的反應液，用PBS洗滌3次，加入0.1mol/L NaOH溶液消化細胞10min，將細胞消化液移入塑料管，用γ計數器測量每管內溶液的γ計數。經GraphPad Prism4飽和曲線擬合程序處理得到125I-Ang II受體結合飽和曲線。

3.1 競爭性實驗：

藥物溶液：取一定量的化合物溶于1 mL的DMSO溶液，濃度為10-2 M，再10倍稀釋成不同濃度的溶液（1×10-10 M ～1×10-4 M）。

細胞鋪板（1×107/孔）后，每孔加入0.1 nM 125I-Ang II以及不同濃度的新化合物（終濃度1×10-6 ～ 1×10-12 mol/L），總體積為1000 μL，4℃反應150 min，反應結束后去除游離的125I-Ang II，用PBS洗滌3次，加入0.1 mol/L NaOH溶液消化10 min，將細胞液移入塑料管，用γ計數器測量每管內溶液的γ計數。經GraphPad Prism 4競爭結合曲線擬合程序處理即可得出新型化合物抑制與膜蛋白結合的半抑制常數和IC50值。

3.2 體內降壓實驗

低劑量組（10mg/kg）、高劑量組（15mg/kg、陽性對照組（洛沙坦 10mg/kg）、陰性對照組。

方法：（1）大鼠加溫和固定：采用全身加溫加溫。固定采用有機玻璃固定器。2）確定起始脈搏水平：將鼠尾依次穿過尾套和脈搏換能器，調整尾巴位置和儀器增益，使尾動脈脈搏信號足夠大。（3）測定血壓：用橡皮球充氣加壓，使尾套內壓力升高至脈搏完全消失，再加壓20-30mmHg（2.66～3.99），然后緩慢放氣減壓直至脈搏信號恢復起始水平，這時從測壓儀的顯示屏上就可讀取收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率，連續測3次，取其平均值作為測定值。

4 統計學處理

數據采用GraphPad Prism 4作圖軟件和Excel2007軟件作統計學分析，并制作圖表，組間差異比較采用方差分析，數據采用x±s表示。

5 實驗結果

5.1 經過GraphPad Prism 4競爭結合曲線擬合軟件處理后得出IC50值，其中，氯沙坦和新型化合物的IC50分別為 1.27±0.23，3.98±1.21，可見兩者的數據具有顯著性差異（P<0.01）。

5.2 經過無創微動脈血壓儀測出了新型化合物的最大降壓值，低劑量組中新化合物給藥后在1-3h里血壓出現明顯降低趨勢，在第三個小時達到最大降壓值28 mmHg，隨后血壓保持平穩，直至24小時后低劑量組與陰性對照相比仍有顯著性差異。而在高劑量治療組中，新化合物給藥后在1-3h里血壓出現明顯降低趨勢，在第三個小時達到最大降壓值30 mmHg，隨后血壓保持平穩。

6 討論

從受體結合試驗的和體內降壓實驗中可以看出，新型化合物1具有較好的降壓效果，降壓時間長，效果穩定，可以作為新藥進行進一步的研究。