載5—氟脲嘧啶納米纖維膜的制備及其對肝癌細胞抑制作用的研究

萬娜 劉志強 陳志龍

【摘要】研究化療藥物5-氟脲嘧啶（5-FU）的聚乳酸（PLLA）納米纖維膜的制備及其對肝癌細胞的體外抑制效果。采用靜電紡絲方法制備載5-FU納米纖維膜。通過掃描電鏡（SEM）觀察其形貌。采用噻唑藍（MTT）比色法，檢測納米纖維膜對肝癌細胞SMMC-7721的體外殺傷效果。結(jié)果表明：由SEM可以看出5-FU能夠均勻分布在納米纖維藥膜中， MTT檢測載5-FU納米纖維膜對SMMC-7721有殺傷作用。

【關(guān)鍵詞】5-氟脲嘧啶；納米纖維膜；抗腫瘤；肝癌

原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，2000年全球因肝癌死亡者高達54.86萬人，5-氟脲嘧啶（5-FU）是在化療中應(yīng)用廣泛且療效確切的化療藥物。近些年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，靜電紡絲受到了越來越多的關(guān)注。同時，基于電紡納米纖維作為給藥系統(tǒng)的研究也越來越引起人們的注意，用電紡納米聚合物纖維作為給藥系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。本文以抗癌化療藥物5-FU作為模型藥物，以聚乳酸（PLLA）作為藥物的載體高分子材料，采用靜電紡絲技術(shù)制備了抗癌藥物/PLLA載藥納米纖維膜，對此類藥物臨床新劑型的開發(fā)應(yīng)用做出初步探索。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

采用靜電紡絲技術(shù)制備載藥量分別為1%，3%和5%的5-FU/PLLA納米纖維膜，5-FU由本實驗室自制；人肝癌細胞株SMMC-7721購買自上海中科院生物細胞庫；氯仿（上海化學(xué)試劑有限公司）；丙酮（中國上海試劑總廠）；乙酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；聚乳酸（PLLA）（濟南岱罡生物科技有限公司）； MTT（Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（吉諾生物有限公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，上海光學(xué)儀器廠）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

稱量好一定量的聚乳酸PLLA溶于氯仿和醋酸的混合溶液中，放在恒溫（室溫）磁力攪拌約2-3小時，以得到均勻的溶液。同時稱取一定量的化療藥物5-FU倒入上述混合溶液中，攪拌使其與PLLA溶液充分混合以制備均勻的溶液。最后在電紡前加入一定量的丙酮溶劑，繼續(xù)攪拌大約20-30分鐘。

1.2.2 靜電紡絲

將注有紡絲液的5ml注射器固定在微量注射泵上，調(diào)節(jié)枕頭（針頭口徑為0.7mm）與接收鋁箔的距離為13cm，陽極與針頭相連，陰極連接鋁箔，并將微量注射泵的流量設(shè)定為0，8ml/h，電壓設(shè)置為16kV，紡絲液在高電場的作用下形成符合納米纖維，電紡纖維以無紡膜的形式收集在接收鋁箔上。

1.3 納米纖維微觀形貌的觀察

將制成的樣品放入真空干燥箱干燥后，用掃描電鏡SEM觀察其微觀形貌。

1.4 5-FU/PLLA納米纖維膜的細胞抑制實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng)

肝癌細胞SMMC-7721培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。在含5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育。隔天換液，細胞鐵壁密度達80%左右傳代。

1.4.2 實驗分組

共分為4組，純膜組為不含5-FU的PLLA納米纖維膜，實驗組分別為載藥量為1%，3%和5%的5-FU/PLLA載藥納米纖維膜。

1.4.3 MTT測定SMMC-7721細胞的抑制率

將納米纖維膜制成直徑為1cm的圓形薄片，放入24孔板中。加入高濃度雙抗浸泡后再用RPMI1640培養(yǎng)液浸泡漂洗，干燥后以備細胞培養(yǎng)。取SMMC-7721細胞懸液加入24孔板（3×104/孔），5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜后棄去原液，每孔加入10%MTT溶液的培養(yǎng)液，繼續(xù)于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)的上清液，每孔加入DMSO，行MTT檢測（檢測波長為490nm），并計算細胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維形貌觀察

圖1是同一紡絲工藝下，靜電紡PLLA和載藥PLLA納米纖維膜的掃描電鏡圖片。從圖中可以看出，在濃度為5%PLLA體系中，當(dāng)藥物的濃度為1%，3%時纖維的產(chǎn)量較高，納米纖維沒有珠節(jié)存在，成形較好，且分布比較均勻。當(dāng)5-氟脲嘧啶的濃度為5%時，這時的靜電紡絲效果不佳，在纖維的表面可以很明顯的看到珠串現(xiàn)象以及纖維之間出現(xiàn)了黏連和分支現(xiàn)象。

圖1 SEM觀察結(jié)果。（a）純PLLA；（b）1% 5-FU；（c）3% 5-FU；（d）5% 5-FU。

2.4 載5-FU納米纖維膜對SMMC-7721細胞的抑制作用

根據(jù)實驗結(jié)果可知，隨著納米纖維膜中5-FU的含量增加，納米纖維膜對細胞的抑制作用也逐漸增強。當(dāng)載藥量為1%時，對細胞的抑制率為32.41%；當(dāng)載藥量增加到3%時，對細胞的抑制率增加到61.4%；當(dāng)載藥量為5%時，此時對細胞的抑制率高達89.90%。說明隨著藥物的含量增加，該納米纖維膜對SMMC-7721的殺傷作用有逐漸增強的趨勢。而不含5-FU的純PLLA納米纖維膜則基本沒有細胞抑制作用，其細胞抑制率僅為4.62%。

3 結(jié)論

（1）通過靜電紡絲技術(shù)制備了載5-氟脲嘧啶的納米纖維膜，以幾乎不溶于水的化療藥物為藥物模型，制備了一種抗癌藥物新劑型，改善了由于傳統(tǒng)給藥方式對患者所造成的傷害以及藥物的毒副作用和提高了藥物的生物利用率等。

（2）通過掃描電鏡SEM觀察到載藥電紡纖維膜形態(tài)均勻。加入藥物后對靜電紡絲形態(tài)沒有影響，藥物在PLLA納米纖維中均勻分布。

（3）通過對載藥納米纖維膜的細胞水平的評價可知，載藥纖維膜對腫瘤細胞SMMC7721有抑制的作用，可以作為抗癌藥物的新劑型用于后期的實驗研究。