骨形成蛋白—2和牙胚細胞聯合作用誘導人牙周膜干細胞表達成牙骨質細胞的表型研究

童曉潔　蘭澤棟　鄭雅心等

[摘要]目的：探討大鼠牙胚細胞（Tooth germ cells， TGC）與骨形成蛋白-2 （Bone morphogenetic proteins-2，BMP-2）聯合作用對人牙周膜干細胞（Human periodontal ligament stem cells， hPDLSCs）向成牙骨質細胞表型分化的作用。方法：將免疫磁珠法分離的hPDLSCs與TGC共培養，并加入50ng/mL的BMP-2，通過RT-PCR， 茜素紅染色和堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase， ALP）活性檢測等方法分析其相關成牙骨質基因及蛋白的表達變化。結果：誘導后hPDLSCs 的ALP活性明顯升高（P<0.001），牙骨質細胞相關基因如牙骨質附著蛋白（Cementum attachment protein，CAP）、牙骨質蛋白（Cementum protein1，CEMP-1）、ALP，骨鈣素（Osteocalcin，OCN）的轉錄水平表達量均有不同程度的增高（P<0.001）。礦化誘導14d后，誘導組形成大量礦化結節，與對照組相比具有統計學意義（P<0.001）。結論：TGC與BMP-2聯合作用能夠誘導hPDLSCs與向成牙骨質細胞的表型分化。

[關鍵詞]牙周膜干細胞；骨形成蛋白-2；成牙骨質細胞；牙胚細胞

[中圖分類號]R246.83 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）16-1343-06

Abstract： Objective To investigated the role of Bone morphogenetic protein-2 （BMP-2） as a factor to induce human periodontal ligament stem cells （hPDLSCs） differentiate into cementoblast or cementum like cells when co-cultured with tooth germ cells（TGC）. Methods hPDLSCs isolated by magnetic-activated method. The cells were co-cluture with tooth germ cells （control group） or co-cultured with tooth germ cells containing BMP-2（test group）.Then RT-PCR， Alkaline Phosphatase （ALP） analyses and mineralization assay were used to identify the cementoblast markers， such as CAP（Cementum attachment protein），CEMP-1（Cementum protein1），ALP and OCN （Osteocalcin）. Results The induced cells showed high ALP activity （P<0.001）， increased calcified nodules formation（P<0.001） and a significantly increase cementum-related genes expression such as CEMP-1，CAP，ALP and OCN （P< 0.001）. Conclusion hPDLSCs co-culture with TGC containing bone morphogenetic proteins-2 acquired more cementoblast features.

Key words：periodontal ligament stem cells； bone morphogenetic protein-2；cementoblast； tooth germ cells

牙骨質是覆蓋在牙根表面的一薄層礦化組織，當牙骨質發生吸收或破壞時其自我修復能力有限，定向誘導hPDLSCs分化為成牙骨質細胞使牙骨質再生是牙周組織工程的重要內容。微環境[1]和細胞因子在牙周膜干細胞的增殖和分化過程中發揮著重要的作用，本研究擬將細胞因子和微環境聯合作用來誘導hPDLSCs向成骨質細胞分化，為牙骨質的再生提供一些理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：主要試劑：α-MEM培養基（Gibco，USA），胎牛血清（FBS， Gibco， USA），胰蛋白酶（Gibco， USA），Ⅰ型膠原酶（Sigma，USA）， Dispase酶（Sigma，USA），免疫磁珠試劑盒 （Dynal biotech，USA），小鼠抗人STRO-1單克隆抗體、小鼠抗人CD146單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白多克隆抗體、小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體（Life Technologies，USA）；Hoechst（Sigma，USA）；BMP-2（Peprotech，USA）； ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）。主要儀器：倒置顯微鏡（Olympus， Japan）；免疫熒光顯微鏡（Leica Japan）；Real- time PCR 儀（Bio-Rad， USA）； 磁力架（Dynal biotech，USA）；Transwell （Milliport，USA）。

1.2 hPDLSCs的培養與分離[2]：遵循知情同意原則收集臨床上因正畸需要拔除的牙周健康無齲的前磨牙，PBS反復沖洗牙齒，11號刀片快速刮下根中1/3部分的牙周膜，加入3mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的Dispase酶，37℃消化1h， 70μm濾膜過濾器獲得單細胞懸液， 將細胞接種于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 維生素C的α-MEM培養基中， 37℃，5%二氧化碳孵箱中培養，每3天換液，細胞生長達80%時傳代，取第2代牙周膜細胞，根據免疫磁珠試劑盒說明書分離hPDLSCs并擴增。

1.3 hPDLSCs的鑒定：采用免疫細胞化學染色方法對 hPDLSCs進行鑒定。將經磁珠法篩選獲得的 hPDLSCs（+）和 hPDLSCs（-）細胞分別制作細胞爬片，4%多聚甲醛固定細胞，PBS清洗，1%BSA室溫封閉30min，阻斷非特異性結合，分別滴加STRO-1、CD146、角蛋白和波形蛋白一抗以及PBS，4℃孵育過夜。PBS沖洗，滴加熒光二抗，37℃染色45min，Hoechst染色5min，PBS清洗后熒光封片劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.4鼠TGC的制備：選用5只出生后8天的Sprauge-Dawley大鼠，斷頸處死，分離出下頜骨，體視顯微鏡下取出下頜骨中4個第一磨牙牙胚，去掉牙釉質，將牙胚組織剪碎后加入3mg/mL的 I型膠原酶和4mg/mL Dispase酶，37℃消化1h。將細胞接種于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 維生素C的α-MEM培養基中，37℃，5%二氧化碳孵箱中培養，2～3天換液.細胞匯合達80%時備用。

1.5 hPDLSCs向成牙骨質細胞分化的定向誘導：誘導組將TGC和第3代hPDLSCs以2×105/mL接種至六孔板和Transwell進行共培養并加入含50ng/mL BMP-2的α-MEM培養基；對照組不加50ng/mL BMP-2，每隔1天換液。

1.6 ALP活性檢測：分別收集實驗組和對照組3，6，9d的細胞依照ALP試劑盒說明書進行ALP活性檢測。

1.7 RT-PCR檢測：分別收集誘導組和對照組3d的細胞，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。根據 LightCycler R 480 SYBR Green I Master反應程序進行PCR擴增，檢測CAP、OCN、ALP、CEMP-1基因的表達以GAPDH為內參照，引物設計見表1，由英偉創津公司合成。

1.8 茜素紅染色：按上述分組將hPDLSCs以2×105/mL密度接種至誘導組和對照組，培養基中添加含10mmol/L的β-甘油磷酸鈉進行礦化誘導，每隔2d換液，連續培養14d后， 4%多聚甲醛常規固定，PBS清洗，加入 0.1%茜素紅染色30min后去除染色液，PBS潤洗，相差顯微鏡下進行觀察拍照，然后用含5% 十二烷基硫酸鈉（SDS）的0.5N 鹽酸溶液溶解著色的礦化結節30min，溶解液稀釋10倍移至96孔板中，405nm波長測各孔吸光值。

1.9 統計學分析：所有數據采用SPSS16.0軟件進行統計學處理。兩組間樣本均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1原代培養的PDLSCs，第2天開始出現貼壁生長，細胞多為長梭形，少量星形細胞，胞體豐滿，胞質均勻，核圓形或橢圓形，位于細胞中央，細胞增殖能力強，5～6天即可達到瓶底覆蓋率的80%（A）。經免疫磁珠分離的hPDLSCs胞漿被大量磁珠緊密包裹，貼壁生長2～3天后細胞伸展呈長梭形，磁珠貼合在細胞表面，不影響細胞生長，吹打或沖洗細胞以及傳代后磁珠依然不脫落（ B），如圖1。

2.2 hPDLSCs的免疫細胞化學染色結果示hPDLSCs（+）表達早期間充質干細胞表面標志物STRO-1（A）和血管周圍細胞標志分子CD146（B）；hPDLSCs（-）不表達（C）和（D）。PDLSCs（+）和PDLSCs（-）細胞胞漿波形蛋白抗體染色均為陽性（E），角蛋白抗體染色均為陰性（F），說明所有細胞來源于間充質組織沒有上皮細胞的污染。PBS染色的對照組里沒有見到任何染色的細胞（G），說明篩選結果具有可靠性（如圖2）。

2.3鼠TGC的制備，體視顯微鏡下出生后8天的SD大鼠下頜第一磨牙牙胚（A），倒置顯微鏡下觀察到呈鵝卵石樣的上皮來源細胞（B）和類似紡錘樣的間充質來源細胞（C），及兩種細胞的交界處（D）（如圖3）。

2.4 ALP活性檢測顯示和對照組相比，經BMP-2和TGC聯合誘導后，hPDLSCs的ALP活性明顯升高（如圖4）。

2.5 RT-PCR結果顯示誘導后的hPDLSCs，牙骨質相關基因CAP、CEMP-1、ALP 和OCN的表達量較對照組均有明顯升高，其中CEMP-1和ALP升高最明顯（如圖5）。

2.6 茜素紅染色，將誘導組和對照組分別添加β-甘油磷酸鈉礦化誘導14天后，誘導組表面形成大量的礦化結節（B），非誘導組僅有少量的礦化結節形成（A）。兩組相比具有明顯的統計學意義（C）（如圖6）。

3 討論

PDLSCs是牙骨質、牙周膜和牙槽骨再生的前體細胞[3]，是牙周組織再生的種子細胞[4]，干細胞的定向分化需要特殊的微環境和相關信號分子的聯合作用[1，5]。如何有效誘導hPDLSC定向分化為成牙骨質細胞是牙骨質再生的研究難點和熱點。

目前，關于牙骨質再生的研究主要集中在利用各種細胞因子的單向誘導作用，如牙本質非膠原蛋白（dentin non-collagen protein， DNCPs），BMP-2，釉基質蛋白衍生物（Enamel Matrix Derivative， EMD）等，并無法真正模擬成牙骨質細胞分化的微環境[6-9]。牙根發育是一個復雜的過程，在牙根發育過程中，當根部牙本質形成時，包繞牙根的上皮根鞘斷裂成網狀，牙囊細胞穿過斷裂的根鞘上皮，進入新形成的牙本質表面分化為成牙骨質細胞。這個過程涉及復雜的調控信號，如上皮和間充質細胞間的交流信號，牙囊細胞和牙本質的接觸信號等，為此越來越多的學者認為根端牙胚微環境在牙根發育中發揮著重要作用，有研究認為[10]，根端牙胚細胞培養液可以作為hPDLSCs向成牙骨質細胞分化的微環境，誘導后的hPDLSCs成骨或成牙骨質相關基因ALP和I型膠原酶（Type I collagen，Col I）的表達量明顯增加，但牙骨質特異性蛋白CEMP-1和對照組相比沒有明顯變化，也沒有發現骨涎蛋白（Bone sialoprotein， BSP）和OCN的表達。由此我們推測根端牙胚細胞是一個復合細胞群，含有上皮細胞和間充質細胞，它們一起混合培養是一個上皮細胞和間充質細胞交流的過程，可以為成牙骨質細胞的分化提供一定的微環境，但可能還需要更多的牙囊和牙本質的接觸信號和其他相關信號因子的參與來彌補單一微環境或單一細胞因子誘導hPDLSCs向成牙骨質細胞分化的不足。BMP信號通路被認為在轉錄水平參與了PDLSCs向成牙骨質細胞的分化[11]，BMP-2，4，7會在上皮和間充細胞間進行轉移，介導上皮和間充質之間的信號交流。許多研究[12-13]已報道BMP-2可促進牙槽骨、牙骨質和牙周韌帶的再生。BMP-2可以誘導成牙骨質細胞的祖細胞（牙囊細胞）向成牙骨質細胞方向分化并刺激細胞表達牙骨質標志性蛋白CAP和（或）CEMP-1[14，7]，也可以誘導人牙周膜細胞中的祖細胞表達CAP，并認為BMP-2的最佳有效濃度是50ng/mL[15 ]。

利用根端牙胚作為誘導培養基時，根端牙胚的制取復雜，根端牙胚的界限也值得商榷，所得由牙囊細胞，牙乳頭和上皮根鞘組成的根端牙胚細胞比例存在較大的人為因素的差異，所以本實驗擬采用大鼠的整個牙胚細胞做為誘導培養基，而不是只局限于根端組織，從而優化誘導培養基的制備方法，為其提供更多的牙囊牙本質接觸信號。據文獻報道[16]，出生后8天的大鼠牙胚亨廷頓上皮根鞘（Hertwig's epithelial root sheath，HERS）開始向根端延伸形成上皮根鞘，將牙囊細胞和牙乳頭細胞分隔開，開始牙根的發育和形成，我們推測這個時期的牙胚細胞具有豐富的成牙骨質細胞分化相關的信號，另外牙乳頭細胞可以分化為成牙本質細胞，形成牙本質及牙本質基質可以為我們提供更多的牙囊和牙本質的接觸信號，因此本實驗選用出生后8天的大鼠TGC，作為誘導微環境并添加50ng/mL的BMP-2誘導hPDLSCs向成牙骨質細胞分化。

牙骨質附著蛋白（CAP）[17-19]是一種細胞外基質蛋白，表達于牙骨質，牙周膜細胞和牙槽骨細胞，與成牙骨質細胞的祖細胞遷移并附著至牙根表面有關，因而被稱為牙骨質附著蛋白，是目前已被公認的可以作為成牙骨質細胞與成骨細胞鑒別的特異性標志分子。CEMP1[20]作為一種成牙骨質細胞分化和類牙骨質機制礦化局部調節因子只在成牙骨質細胞和它的前體細胞及一些牙周膜細胞中表達，而在成骨細胞中不表達。它能促進成牙骨質細胞特異性標志物的表達而抑制PDLSCs向成骨細胞分化[21]。ALP[22]作為一種牙源性間充質細胞向成牙骨質細胞/成骨細胞分化的早期標志物，也是反應礦化形成細胞功能狀態的重要指標。在本實驗中，通過TGC和BMP-2的聯合作用可以誘導hPDLSCs表達CAP、CEMP-1這兩種牙骨質特異性基因，并且具有統計學意義（P<0.001），同時OCN和ALP的表達量較非誘導組也有了明顯的升高（如圖5）。ALP活性檢測結果也從蛋白水平說明誘導組的ALP活性較對照組顯著增高見（P<0.001），如圖4；另外經過14天的礦化誘導，誘導組的礦化能力與對照組相比也有明顯的升高見（如圖6）。由此可見，TGC為hPDLSCs向成牙骨質細胞的定向分化提供了一個適宜的微環境，BMP-2作為信號分子介導了上皮和間充質之間的信號傳導，從而使hPDLSCs表達成牙骨質細胞表型。

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[收稿日期]2014-06-08 [修回日期]2014-07-20

編輯/何志斌