脂肪組織工程的研究進展

劉亞南　郭杰　張煒

隨著經濟的高速發展和人們生活水平的日益提高，在滿足物質和精神需求的同時，人們對美的要求也不斷提高，迫切需要一種安全、簡單、有效的美容方式。微整形應運而生，注射美容手術為微整形的典型代表，其原理為直接將填充物注射于患者皮下或特定部位，來改善局部外觀，從而達到美容的效果，已廣泛應用于除皺、局部凹陷填充、隆鼻、隆乳等美容手術。關于理想的注射用填充劑的選擇一直在探索中，理想的軟組織填充劑應具備以下優點：局部注射不引起變態反應或炎癥反應；不易機化、變性、壞死或被周圍組織吸收；不會因吞噬作用被清除；在形態上具有一定的支撐作用，能保持相對固定的體積和柔韌度；無游走性，塑形效果相對穩定。注射美容手術的發展很大程度上依賴于注射材料的選擇，利用脂肪組織工程技術選擇合適的注射材料已成為研究熱點。

脂肪組織工程技術是利用脂肪干細胞和相應的生物支架材料對病變的組織和器官進行修復重建。選擇合適的種子細胞和生物支架材料并建立兩者間三維空間結構是脂肪組織工程技術的關鍵。合適的種子細胞應滿足以下幾點：增殖能力及分化能力較強，在培養基中加入相應誘導劑可調控其分化方向；生存周期較長，對培養基的要求較低；取材簡單，易從相應組織中分離提取。Yoo等[1-2]研究指出合適的細胞支架材料必須符合：支架材料的形態和結構對新生組織生長起到引導作用；起到載體的作用，可將種子細胞輸送到指定的空間；可為種子細胞的新陳代謝提供場所，清理代謝所產生的廢物，并不斷為新陳代謝提供營養；材料表面的特殊位點與種子細胞有特異性的粘附作用；起到機械支架的作用，能夠維持組織原有的機械結構；可作為種子細胞活性因子的載體。

1 脂肪組織工程的研究現狀

1.1 脂肪組織工程的原理和方法：傳統的填充方法包括同種自體移植、同種異體移植、異種異體移植及人工替代品。但這些方法常由于組織細胞的凋亡壞死、延遲的血循重建、組織萎縮等原因而無法達到理想效果[3]。而脂肪組織工程技術被認為是替代傳統脂肪移植術最理想的方法。脂肪組織工程技術包含幾大重要部分[4]，包括理想的種子細胞，合適的生物支架材料及適宜的微環境。脂肪組織工程技術是利用脂肪干細胞和相應的生物支架材料對病變的組織和器官進行修復重建

1.2 脂肪組織工程的研究策略：關于脂肪組織工程的研究策略，國內外學者經過不斷的研究，總結如下：①利用相應的生物支架材料引導組織再生的脂肪組織工程（Scaffold guided tissueregeneration）：將種子細胞與生物支架材料以適當比例混合[5]，植入機體缺損或病變部位，種子細胞不斷地增殖分化，支架材料在此過程中為其提供適宜其生長的微環境，同時其在體內不斷降解并吸收，從而形成與機體正常組織功能、形態相接近的再生組織，進而形成新的脂肪組織，達到對缺損及病變組織修復及重建的目的；②可注射復合材料脂肪組織工程技術（Injectable composite system）：將凝膠介質與微載體復合材料混合，并注射到機體病變或缺損的部位，微載體凝膠復合物可刺激機體脂肪細胞增殖從而達到對病變或缺損部位修復重建的目的[6-7]；③腹網膜的脂肪組織工程技術[8]（Fragmented omentumbased-tissueregeneration）：腹網膜組織含有豐富的脂肪組織及血管，可為種子細胞的生長提供良好的微環境，將腹網膜組織處理成碎片，并將其與脂肪干細胞混合，植入人體缺損部位，缺損部位脂肪組織大量增加，在一定程度上對缺損部位起到修復重建的目的；④相關生長因子促進脂肪組織再生的脂肪組織工程技術[9-10]（Denovo adipogenesis）：將脂肪干細胞與相關生長因子一同使用，并注射到機體所需要的部位，生長因子可促進脂肪干細胞大量增殖，從而使得分化的脂肪組織大量增加，對病變部位進行修復、對缺損部位進行重建。

1.3 脂肪組織工程的關鍵：脂肪組織工程的研究策略千變萬化，但其關鍵在于如何選擇理想的種子細胞、合適的支架材料。研究發現，以來源于脂肪組織的脂肪干細胞復合相關生物支架作為填充物，可明顯促進軟組織的血管化、提高移植物的存活率。應用組織工程技術將種子細胞復合不同生物支架作為填充物為臨床提供一個新的研究方向。其中種子細胞可以選為脂肪干細胞，細胞支架材料可以選擇游離脂肪顆粒和相關注射材料（透明質酸鈉、膠原等）。

2 種子細胞的相關研究

2.1 ADSCs的發現和命名：Zuk等[11]于2001年首次從脂肪組織中分離并提取出成體細胞，命名為Processed Lipoaspirate cells（PLAS），即抽脂術細胞，并得到了快速的發展。隨著研究的不斷深入，學者們也從不同研究角度給予該細胞不同命名。現在比較公認的稱為脂肪來源干細胞（ADSCs）。

2.2 ADSCs的分離和純化： 脂肪干細胞來源廣泛，較易于從人體或動物的脂肪組織中分離提取，ADSCs的提取方法很多，但提取出來的都非單一的脂肪干細胞，而是相關的細胞群。在整形外科領域，我們所需的脂肪組織常來源于脂肪抽吸術的患者，將所得脂肪組織用組織剪剪成細小的顆粒，并用PBS液沖洗干凈，用0.1%的膠原酶在37℃下進行消化，置DMEM培養進行培養，并加入10%胎牛血清。進行離心，棄其上清液及游離脂肪組織，經過濾純化后將所得細胞置于培養瓶中進行培養，2天后換液，以后3天換液一次，收集第3代細胞作為種子細胞。我們無法直接純化脂肪干細胞，常通過純化脂肪組織來間接達到純化脂肪干細胞。流式細胞儀檢測結果顯示：傳至第3代時，脂肪干細胞的純度可達到95%以上。

2.3 ADSCs的生物學特性

2.3.1 ADSCs可分泌多種生長因子：研究發現，脂肪干細胞在一定條件下可產生多種生長因子，如：血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子（TGF）、肝細胞生長因子（HGF）、胎盤生長因子（PGF）及成纖維細胞生長因子（bFGF）等。其分泌的血管內皮生長因子可促進血管生成、抗凋亡作用、成纖維細胞生長因子具有趨化作用、免疫抑制及造血支持作用。

2.3.2 ADSCs的多向分化能力：脂肪干細胞具有較強的增殖能力和生命周期、排斥反應低、取材簡單方便、能建立標準的細胞系等優點。在一定條件下可分化為特定的體細胞，在組織工程研究領域有著巨大價值：① ADSCs可向脂肪細胞分化：Zuk等[12]研究發現，在一定條件培養基中加入適量的胰島素、地塞米松、吲哚美辛，3周后可檢測出ADSCs表達許多脂肪細胞的特異性標記：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸結合蛋白aP2、PPAR-r2、lepIin（瘦素）、Glut4（葡萄糖轉運蛋白4）等。顯微鏡下可見空泡結構形成。組織學證明新生的細胞為脂肪細胞；② ADSCs可向血管內皮細胞分化：將ADsCs置于含甲基纖維素和血管內皮生長因子的、特定培養基上進行培養。鏡下可見有分支狀的管腔結構形成，免疫組化證實有內皮細胞特異性的表面標記CD3l和vW因子。Plarlat等[13]研究發現將培養一定時間的ADSCs注入小鼠后肢缺血的肌肉中，15天后，經血管造影及超聲檢查顯示小鼠缺血征像明顯改善，此項研究表明ADSCs在一定條件下可向血管內皮細胞分化；③ADSCs向成骨細胞分化：Zuk等、Christian等研究結果顯示，在特殊培養基誘導下，h-ADSC8在加入維生素C、B一磷酸甘油（BGP）和維生素D3的培養基中培養幾代后，細胞表面形成的突起，其形態與體內的成骨細胞相似，用茜素紅染色可見細胞內出現了鈣小結，ADSCs形態發生變化，且能表達堿性磷酸酶等相關標記，表現出成骨細胞的特性。國內有學者[14]證實了此點，在體外經成骨誘導后其堿性磷酸酶活性及細胞外基質礦化程度較對照組明顯升高，均表現出成骨分化的特性；④向軟骨細胞分化：在體外，將維生素C、轉化生長因子、胰島素添加到特定培養基里，可以定向誘導ADscs向軟骨細胞分化。結果在培養基里形成了細胞小結，經免疫組化分析得知，這些細胞小結表達Ⅱ型膠原纖維、硫酸軟骨素、硫酸角質素[15]。楊亞軍[16]用CDMPl體外誘導sD大鼠脂肪干細胞，結果誘導后的脂肪干細胞形態由長梭型向軟骨細胞的多角形方向轉變。免疫組化顯示CDMPI誘導大鼠ADsCs后可以分泌軟骨特異性基質糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原，并進一步向軟骨細胞方向分化增殖[17]；⑤向心肌細胞分化：從脂肪組織中分離的脂肪基質血管組分（SVF）即不含成熟脂肪細胞的脂肪組織，且具有干細胞特性，直接種植在半固體的甲基纖維素培養基中，6d后，出現了各種不同的細胞形態，有成群的前脂肪細胞/脂肪細胞，成纖維樣細胞等等，11～14天后，一些圓形的細胞開始了獨立的收縮活動，在幾天內，肌管樣結構出現，并大量生長增殖，20～30天后，局部出現了一簇有結合力的細胞群體，和有分支的纖維細胞共同結合在一起。在這期間，24天時，整個局部出現了單一節律的搏動。在分子水平上，這些搏動的細胞能表達幾種心臟特有的mRNA，如：轉錄因子，GATA-4和心室和心房肌凝蛋白輕鏈。這些數據表明了這些搏動細胞的心肌細胞特性[18-20]。向神經細胞方向分化：國外一些研究人員用B-巰基乙醇（B-mercaptoethanol，B-ME）誘導h-ADSCs向神經細胞分化，30min后即出現類神經元樣的細胞，3h后出現了神經元細胞表型，表達神經細胞早期階段的標志性因子，這證明了ADSCs能在體外分化為神經前體細胞，目前技術水平尚不能使之向成熟的神經元細胞或星型膠質細胞分化[21-23]。

3 支架材料的相關研究

3.1 支架材料的性質：細胞支架材料是組織工程的核心內容之一，理想的支架材料對組織工程的實驗結果會產生巨大的影響，應滿足：①可降解性；②排斥反應小，與組織相容性好；③適合種子細胞嵌入的孔徑；④合適的表面積及理化性質；⑤其結構強度能與植入部位組織的力學性能相匹；⑥具有一定的可塑性。

3.2 支架材料的作用：支架材料在組織工程中起到了至關重要的作用：①支架材料可引導種子細胞的生長；②為種子細胞的生長提供空間；③提高營養，清除廢物；④對不同的種子細胞有特征性連接位點，可使種子細胞特異性粘附于支架材料的特殊位點；⑤不會改變組織本身的形態；⑥可作為某些細胞因子的載體。

3.3 支架材料的種類：脂肪組織、透明質酸和膠原為組織工程中常用的生物支架，也廣泛應用于整形外科領域，可以與脂肪干細胞相結合，兩者具有一定的協同作用。脂肪顆粒可來源于人體或動物皮下脂肪，取材廣泛、簡單、足量，且與機體相容性好、排斥性較低，是組織工程中天然的生物支架。研究證明脂肪來源干細胞在向脂肪細胞轉化的同時也可向血管內皮細胞分化，并分泌EGF、FGF等生長因子，改善局部血液循環，促進局部細胞增生分裂從而減少細胞缺血時間，降低細胞液化吸收比率，使脂肪來源干細胞和脂肪顆粒兩者具有一定的協同作用。透明質酸基本成分為高分子多糖，是世界上公認的保濕劑，在一定條件下極易降解，且免疫排除性較小，已廣泛應用于骨科關節疾病的治療，作為組織工程支架具有廣闊的前景。膠原是屬于細胞外基質的結構蛋白質，廣泛存在于脊椎動物和人的皮膚、肌腱、韌帶、軟骨及骨等組織或器官中。它的主要成分是糖蛋白。約占機體總蛋白的25%。膠原具有很好的生物學性能，是目前組織工程研究中最常用的天然生物支架材料[24]。在整形外科領域，這三種支架材料已得到了廣泛的應用。研究發現，生物支架材料可為種子細胞的生長提供合適的三維空間結構及適宜的微環境，在一定程度上可促進脂肪干細胞的生長和分泌。

4 脂肪組織工程研究展望

自體脂肪移植已廣泛應用于臨床，是整形外科醫生對臨床組織缺損患者進行修復重建的一種常規方法，但單純脂肪移植存活率低、吸收率高，不能達到理想的效果，限制其在臨床的進一步應用。利用組織工程技術將種子細胞和相應的生物支架結合，從而構建相應的組織和器官，是組織工程的關鍵。將種子細胞在體外進行擴增，并與相應支架材料構建三維空間結構，從而形成種子細胞生物支架復合物，并將其植入機體，對病變或缺損的組織和器官進行修復。在此過程中，種子細胞不斷擴增，來滿足正常組織的需要，相應的生物支架材料為種子細胞的生長增殖提供適宜的微環境，并與機體有良好的相容性，且能不斷降解，被機體吸收。從而使種子細胞生物支架復合物能形成與機體在形態和功能上較一致的組織，達到對機體修復重建的目的。

李劼、高建華、魯峰等[26]將脂肪干細胞與脂肪顆粒以適當比例混合后注射到裸鼠皮下，結果發現，其組織塊的濕重、存活率、血管化程度等都顯著高于單純對照組，其研究證明脂肪干細胞與脂肪顆粒混合移植在一定程度上可促進移植物的血管化程度，從而提高存活率、降低吸收率。這與我們的脂肪干細胞復合脂肪顆粒組的研究結果相符合。龐雪芬、張志光[27]將不同濃度的透明質酸與小豬脂肪干細胞混合培養，結果發現適宜濃度的透明質酸可促進脂肪干細胞的增殖分化能力。這與我們的脂肪干細胞復合透明質酸組的研究結果相符合。許穎溦、劉林嶓等[28]將脂肪干細胞與無菌膠原混合形成細胞支架復合物，注射于裸鼠皮下軟組織，取材后進行相關檢測，其組織塊濕重、存活率、微血管密度均顯著高于單純脂肪顆粒移植組，證明無菌膠原作為生物支架在一定程度上可提高脂肪干細胞的促血管化作用。這些研究為組織工程中生物支架的選擇提供了理論基礎。基于此，脂肪顆粒、透明質酸、無菌膠原做為本實驗的生物支架，可加速脂肪干細胞的促血管化作用，從而證明其作為組織工程中的生物支架材料具有一定的可行性。

傳統的整形外科手術創傷較大、術后并發癥較多、花費高及住院時間長等劣勢，不能適應一些迫切需要微整形的患者需要。據美國的一項統計顯示，微創整形美容手術的數量逐年上升，充分整形美容手術符合社會發展的趨勢，易被廣大患者所接受。隨著微創整形美容的不斷發展，整形美容外科醫師的觀念也在逐漸轉變，微整形已成為一種趨勢。 選擇合適的種子細胞及支架材料，使得注射美容術安全有效是關鍵。

5 存在問題

脂肪干細胞作為理想的種子細胞擁有廣闊的應用前景，它取材簡單、痛苦小、又不涉及相關倫理問題，但是要真正作為一種常規治療方法應用于臨床，還有許多問題需要解決。所用脂肪干細胞由于其供體年齡、性別、取材方法及取材部位的不同可能會對其實驗結果造成一定影響，之前研究已經證實，脂肪干細胞的增殖能力跟供體年齡成反比，脂肪干細胞的活性越強，增殖能力也越強。性別在一定程度上也會影響脂肪干細胞的增殖能力，女性脂肪組織中的脂肪干細胞其增殖能力要高于男性。取材部位也在一定程度上影響著脂肪干細胞的生長周期，從腹部組織中提取的脂肪干細胞其生存周期要遠高于其他部位，這些有待于進一步研究。在支架材料的應用方面有諸多問題尚未解決，一種材料往往不能滿足種子細胞生長的需要，細胞支架材料的研究成了組織工程技術的重點。種子細胞的生長需要合適厚度的支架材料，當支架材料的厚度超過1mm時可能無法為種子細胞提供充沛的營養支持，如何選擇合適厚度的支架材料，并為種子細胞的生長提供最適合的微血管環境有待于進一步研究。總之，現階段研究已經證實，脂肪干細胞復合相關生物支架作為注射美容術中的注射材料具有一定的可行性，且其具有安全、有效、操作簡單及并發癥少等優點，將成為注射美容的一種趨勢，值得臨床推廣應用。

[參考文獻]

[1]Wang Y，Blasioli DJ，Kim HJ，et a1.Cartilage tissue engineering with silk scabfold8 and human articular chondrocytes[J].Biomatefi-als，2006，27（25）：4434-4442.

[2]Yoo HS，Lee EA，Yoon JJ，et al.Hyaluronie acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering[J].Biomaterials，2005，26（14）：1925-1933.

[3]Zuk PA1，Zhu M，Mizuno H，et a1.Multi.1ineage ceIls form hurman adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：211-228.

[4]雷華，李青峰.脂肪干細胞的研究進展[J].中華整形外科雜志，2003，19（6）：465-466.

[5]Fraser JK，Wulur I，Alfonso Z，et al.Fat tissue： An underappreciated source of stem cells for biotechnology[J].Trends Biotechnol，.2006，24：150-154.

[6]Fraser JK，Wulur I，Alfonso Z，et al.Cartilage-like gene expression in differented Human stell cell spheriods：a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stlomal cells[J].Arthritis Rheum，2003，48（2）：418-429.

[7]Erickson GR，Gimble JM，Franklin DM，et a1.Chondrogenic potentials 0f adipose tissue- derived stromal cells in vitro and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，290（2）：763-769.

[8]Yamasaki T，Deie M.Meniscal regeneration using tissue engineering with a scafold derived from a rat meniscus and mesenchymal stromal cells derived from rat bone marrow [J].J Biomed Mater Res A，2005，75（1）：23-30.

[9]Suzuki T，Kobayashi K，Tada Y，et al.Regeneration of the trachea using a bioengineered scaffold with adipose-drived stem cells[J].Annals of Otology Rhinology and laryagology，2008，117：453-463.

[10]Zuk PA，zhu M，Ashjian P，et a1.Human adipose tissue is a sourse of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13（12）：4279-4295.

[11]Hong L，Peptan IA，Colpan A，et al.Adipose tissue engineering by human adipose-derived stem cells[J].J Cells tissue Organs，2006，183（3）：133-140.

[12]Choi YS，Cha SM，Lee YY，et al.Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adault sten cells in nude mouse J[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，345（2）：631-637.

[13]Linksmauney JR，Nguyen Gillen K，et al.Engineering adipose-like in vitro and in vivo uitiling human bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells with silk fibrion 3d scaffolds[J].Biomaterials， 2007，28（35）：5280-5290.

[14]Flynn Prestwich GD，Semple JL.Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells，[J].Biomaterials，2007，28（26）： 3834-3842.

[15]Kim M，Choi YS，Yang SH，et al.Muscle regeneration by adipose tissue-derived adult sten cells attached to injectable PLGA spheres[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，348（2）： 386-392.

[16]Gimble JM，Grayson W，Guilak F，et al.Adipose tissue as a stem cell source for musculoskeletal regeneration[J].Front Biosci（Schol Ed），2011，3：69-81.

[17]Kaplan FS，Hahn GV，Zasloff MA.Heterotopic Ossification：Two rare forms and What they Canteach US[J].J Am Aad Or thop Surg，1994；2：288-296.

[18]楊坤芳，俞光榮.人脂肪來源干細胞培養及向內皮細胞分化能力的研究[J].中華實驗外科雜志，2010，27（10）：1511-1512.

[19]Dudas JR，Marra KG，Cooper GM，et a1.The osteogenic potential of adipose一dived stem cells for the repair of rabbit calvarial defects[J].Ann Plast Surg，2006，56（5）：543-548.

[20]Peptan IA，Hong L，Mao JJ.comparison of osteogenic potentials of Visceral and subcutaneous adipos-derived stem cells 0f rabbits[J].Plast Reconstr Surg，2006，117（5）：1462-1470.

[21]DragooJL，Lieberman JR，Lee RS，et al.Tissue-engineered bone from BMP-2-transduced stem cells derived from human fat[J].Plast Reconstr Surg，2005，115（6）：1665-1673.

[22]Patan LA，Hong L，Mao JJ，Comparison of osteogenic potentials of visceral and subcutaneous adipose-derived cells of rabbits[J].Plast Reconstr sueg，2006，117（5）：1462- 1470.

[23]Aksu AE，Rubin JP，Dudas JR，et al.Role of gender and anatomical region on induction of osteogenic differentiation of human adipose-dierived stem cells[J].Ann Plast Surg，2008，60（3）：306-322.

[24]Kingham PJ，Kalbermatten DF，Mahay D，et a1.Adipose-derived stem cells differentiate into a schwan cell phenotype and promote Neurite outgrowth in vitro[J].Exp Neurol，2007，207（2）：267-274.

[25]陳愛珍，劉楠，黃歡，等.脂肪來源干細胞移植對腦缺血大鼠神經軸突再生的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2011，27（8）：868-871.

[26]李劼，高建華，魯峰，等.脂肪來源干細胞提高游離脂肪存活率的研究[J].中華整形外科雜志，2009，25（2）：129-131.

[27]龐雪芬，張志光，燕子.透明質酸對小型豬脂肪干細胞增殖活性的影響[J].中國現代藥物應用，2010，4：65-68.

[28]許穎溦，劉林嶓.脂肪來源干細胞復合I型膠原促進裸鼠皮下血管化的實驗研究[J].鄭州大學學報（醫學版），2014，23（5）：123-126.

[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-26

編輯/李陽利