離體牙短期應用酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體再礦化的實驗研究

陳燕等

[摘要]目的：評價短期應用10%酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體（complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate，CPP-ACP）（商品名：Tooth Mousse護牙素）離體牙釉質片再礦化的功效。方法：將正畸需要拔出的離體前磨牙15顆從冠根向一分為二，共30個實驗樣本，用自凝材料包埋于塑料圈內，根據掃描電鏡樣品的要求打磨拋光，拋光后的牙釉質面積為3mm×3mm。用數字隨機表的方法隨機分成4個實驗組和1個對照組，每組6個。對照組是用37.5%磷酸酸蝕浸泡牙釉質2 min 后不用護牙素浸泡，實驗組均用37.5%磷酸酸蝕浸泡牙釉質2min后分別用Tooth Mousse護牙素涂搽牙面30 min，置于蒸餾水中浸泡。每組浸泡的時間逐步累加，A、B、C、D實驗組分別浸泡時間為1、5、10、20h 。每組待第2天在同一時間涂搽護牙素及在蒸餾水中浸泡的步驟同第1天 ，每天更換蒸餾水一次。每組連續作用5次。掃描電鏡觀察及用能譜檢測鈣的質量分數 ，統計分析各組釉柱再礦化與浸泡時間的關系。結果：A、B、C、D實驗組釉質表面鈣質量分數是（67.38±0.89、67.63±0.56、67.71±0.52、69.11±0.27）和酸蝕組65.74±0.74之間的差異有統計學意義（F=21.568，P=0.000<0.01）；用（Student-Newman-Keuls）法做多組間樣本均數的兩兩統計比較分析，A、B、C組間差異均無統計學意義（P>0.05）；D實驗組與A、B、C組間差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：Tooth Mousse護牙素體外實驗在蒸餾水環境中多次短時間每天20h浸泡離體牙釉質在減少脫礦和促進再礦化方面較實驗其余3組作用顯著。

[關鍵詞]酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體；釉質；脫礦；再礦化

[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）17-1441-04

Calcium and phosphorus teeth from short-term application of the complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate experimental study on remineralization

CHEN Yan，ZHOU Yan，LI Ming-dong，JIANG Rong-Ling，TANG Ji-wei，LU Qi-fang

（Department of Stomatology，The People's Hospital of Guangxi，Nanning 530021Guangxi，China）

Abstract： Objective To evaluate the effect of complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate application in enamel remineralization in vitro. Methods 30 orthodontic were randomly divided into 4 experimental groups and 1 control groups， each group of 6.The control group with 37.5% phosphoric acid etching of enamel after 2 min immersion Without tooth moussesoaking，experimental groups with 37.5% phosphoric acid etching of enamel after soaking 2min respectively with Tooth Mousse tooth Mousse Tucha tooth 30 min， placed indistilled water immersion.A，B，C，D groups were soaking for 1，5，10，20h.Each stay for second days at the same time Tucha tooth mousse and with the first day the steps of immersing in distilled water. Continuous action each 5 times.Electron microscope andenergy spectrum detection by mass fraction of calciumscan， statistical analysis on the relationship between theenamel remineralization and immersion time. Results A，B，C，D in experimental group， the enamel surface calciummass fraction is（67.38±0.89，67.63±0.56，67.71 ±0.52，69.11±0.27） had significant difference and acid etching group 65.74± 0.74 between （F=21.568，P=0.000<0.01）； （Student-Newman-Keuls） compared with two two statistics do group like the mean difference，A，B，C groups were notstatistically significant （P>0.05）； experimental group D and A，B，C between group differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Tooth Mousse tooth mousse in vitro experiments in distilled water environmentin a short time 20h day soaking in reducing enameldemineralization and remineralization than the other 3 groups significantly effect experiment.

Key words：complex of casein phosphopeptide and amorphous calcium phosphate；enamel；demineralization；remineralization

Tooth Mousse護牙素從牛奶中提取出來的一種生物活性肽-酪蛋白磷酸多肽（CPP-ACP），內含生物活性鈣離子和磷酸離子，可以不斷滲入牙齒表面補充早期齲脫礦牙釉質丟失的礦物質，促進牙釉質的再礦化[1]。前一階段我們的研究顯示：Tooth Mousse護牙素在體外實驗短期連續使用（7天）能使離體牙釉質在蒸餾水環境中抑制脫礦和促進再礦化，與趙瓊芝的研究[2]結果相似。長期使用護牙素（28天）可以加強脫礦的牙釉質再礦化的功效[3]。而在生活中患者無法24h都使用護牙素，每天使用護牙素不同的時間它對牙釉質再礦化的效果是否有不同，這是我們此次實驗研究的目的。

1 材料和方法

1.1離體牙制備：因正畸需要拔出的離體前磨牙，經患者知情同意后清潔后置于生理鹽水中，放于4℃冰箱內保存。體視鏡下挑選釉質表面光滑、顏色正常、無缺損、裂紋及脫礦的離體牙15顆， 清水沖洗后備用。15顆離體牙從冠根向一分為二成為30個牙釉質磨片，長寬高分別為3mm×2mm×1mm。用自凝材料包埋于塑料圈內，根據掃描電鏡樣品的要求打磨拋光，拋光后的牙釉質面積為3mm×3mm，3mm×3mm以外的釉質表面均用抗酸指甲油覆蓋 。

1.2材料和儀器：護牙素（GC Tooth Mousse，GC公司，日本）；掃描電鏡（SU8000，日本）。

1.3實驗方法：實驗：將30個實驗樣本用數字隨機表的方法隨機分成5組即4個實驗組和1個對照組，每組6個。 實驗組均用37.5%磷酸酸蝕浸泡牙釉質2min后分別用Tooth Mousse護牙素涂搽牙面30 min，置于蒸餾水中浸泡，每組浸泡的時間逐步累加， A、B、C、D 實驗組分別浸泡時間為1、5、10、20h 。每組待第2天在同一時間涂搽護牙素及在蒸餾水中浸泡的步驟同第1天 ，每天更換蒸餾水一次。每組連續作用5天。接著每組6個樣本逐一固定于載物臺上，真空噴金，用掃描電鏡 （SU8000，日本）觀察釉質表面的超微結構，并用能譜檢測鈣的質量分數，分析各組牙釉質再礦化與浸泡時間的關系。

1.3 統計學方法：所有數據采用SPSS 17.0統計學軟件對實驗結果進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示；兩組間均數的對比用成組t檢驗；多組之間的比較采用單因素方差分析方法，如多組間對比差別有統計學意義，繼續進行組間的兩兩比較。檢驗水準取α=0.05（雙側）。

2 結果

酸蝕組牙本質小管周圍的牙釉質有程度不等的齲蝕孔隙，呈蜂窩狀、鱗狀改變；實驗A、B、C、D 組釉質表面有大量的礦物質沉積，呈球狀、塊狀覆蓋于釉質表面，填補釉質表面局限性的小凹陷；實驗D組的釉質表面礦物質的沉積比前3組實驗組要致密如圖1～5。酸蝕組和實驗A、B、C、D組釉質表面鈣質量分數是（65.74±0.74 、67.38±0.89、67.63±0.56、67.71±0.52、69.11±0.27），和酸蝕組進行多組間樣本均數的比較，經方差分析（ANOVA）結果為A、B、C、D 實驗組和酸蝕組間的差異有統計學意義（F=21.568，P=0.000<0.01）；用S-N-K法（Student-Newman-Keuls）做多組間樣本均數的兩兩統計比較分析，結果A、B、C組間差異均無統計學意義（P>0.05）；D實驗組與A、B、C 組間差異均有統計學意義（P<0.05），如圖6～10。

3 討論

Tooth Mousse護牙素的主要成分酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體，因其結構內的磷酸化絲氨酸殘基的高負電荷性，使其極易和鈣、磷鹽結合形成膠體狀的酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體，起到磷酸鈣儲存庫的作用，有利于牙釉質再礦化而且酪蛋白磷酸多肽具有黏附在牙面和菌斑上的能力并維持3h以上，可有效延長其作用時間[4]。由于它是一種天然產物，安全性更高，因而臨床使用范圍更廣。

各項研究顯示酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體處于水溶狀態下，能被牙面吸收。以鈣離子橋作為中介，通過氫鍵和離子鍵力以及疏水基團的親和力進入菌斑，抑制細菌黏附，產生間接抑菌、殺菌作用，并且緩沖菌斑酸性環境， 抑制牙釉質脫礦，增加牙釉質齲損再礦化速率，明顯降低患齲率[2，5]。此結果在人磨牙釉質上用顯微放射照相技術和顯微光密度計得到證實[6]。研究表明[7]將牙釉質片浸于無刺激的pH4.8脫礦液中6天，置于37℃的恒溫箱中，每隔兩天換一次脫礦液。分成4組每組分別浸于37℃2%CPP-ACFP溶液中1、3、5、10天，每天換再礦化液，其礦化率分別 9.19%、14.27%、29.07%、38.45%。

CPP-ACP加氟形成酪蛋白磷酸肽鈣氟磷復合體（CPP-ACFP）。Cross等[8]采用核磁共振光譜分析和X線衍射測定CPP-ACFP復合體的超微結構，證明CPPs的功能結構α（S1）-CN（59-79）與ACFP結合后形成半徑（2.12±0.26）nm的無定形的毫微簇，這種毫微簇中每一個縮氨酸結合15個鈣離子、9個磷酸根離子和3個氟離子，這對釉質齲損的再礦化作用相當明顯。因此CPPs可能是運送鈣、磷、氟至牙齒的良好載體[9]。

國內學者張力[10]研究表明，將A、B、C、D組牙釉質片經過人工齲液浸泡和涂0.6%磷酸多肽兩個步驟，4組經人工齲液浸泡時間依次為1、2、12、15h，涂磷酸多肽的時間依次為10、20、120、150min，4組的顯微硬度依次為25.29、16.24、45.30、76.80（KPa/mm2）。結果顯示：前兩組的顯微硬度試驗組與對照組統計學比較無差異，后兩組的顯微硬度試驗組與對照組統計學比較有差異（P<0.01），說明磷酸多肽隨作用時間的延長對牙釉質的礦化作用更明顯。

劉燁等[11]研究觀察基牙金屬烤瓷全冠預備后實驗組表面開窗區涂布護牙素后掃描電鏡下的形態改變 。掃描電鏡下實驗組牙面表面痕跡較淺，見密集鈣質小團的沉積覆蓋牙面，對照組基牙表面條紋狀痕跡明顯，凹凸不平，牙面呈凌亂的疏松無定形狀態。證實含氟酪蛋白磷酸肽-磷酸鈣復合物可以提高酸蝕牙釉質的耐磨性。

本研究結果顯示：A、B、C、D實驗組釉質表面有大量的礦物質沉積，呈球狀、塊狀覆蓋于釉質表面，填補釉質表面局限性的小凹陷；實驗D組的釉質表面礦物質的沉積比前3組實驗組要致密見 ，經方差分析（ANOVA）A、B、C、D實驗組和酸蝕組間的差異有統計學意義（F=21.568，P=0.000<0.01）；用S-N-K法（Student-Newman-Keuls）做多組間樣本均數的兩兩統計比較分析，結果A、B、C 組間差異均無統計學意義（P>0.05）；D實驗組與A、B、C 組間差異均有統計學意義（P<0.05）。

本研究說明Tooth Mousse護牙素體外實驗在蒸餾水環境中多次短時間每天20h浸泡離體牙釉質在減少脫礦和促進再礦化方面較實驗第2階段其余3組作用顯著。結合我們前一階段Tooth Mousse護牙素的實驗結果：在體外連續使用（7天）能使離體牙釉質在蒸餾水環境中抑制脫礦和促進再礦化，長期使用護牙素（28天）可以加強脫礦的牙釉質再礦化的功效[3]。

綜上所述，體外實驗在蒸餾水環境中Tooth Mousse護牙素每天20h浸泡離體牙釉質，連續使用7天，能提高酪蛋白磷酸肽鈣磷復合體的再礦化作用，如果能延長作用時間再礦化作用會更好。但在患者的臨床使用的再礦化作用還受到牙釉質的礦化度、唾液的酸堿度、唾液的量、口腔的菌群、口腔衛生維護的質量等諸多因素的影響，對于齲病易感人群的再礦化作用還有待進一步的研究。

致謝：本研究得到廣西大學材料科學與工程學院曾建民教授、顧紅工程師和溫靜嫻高級實驗師的大力支持，在此表示深深地感謝。

[參考文獻]

[1]Rahiotis C，Vougiouklakis G.Effect of a CPP-ACP agent on the demineralization and remineralization of dentine in vitro[J].JDent，2007，35 （8）：695-698.

[2]趙瓊芝，蔡瑤.酪蛋白磷酸多肽鈣氟磷復合體對牙釉質缺損再礦化的實驗研究[J].中華口腔醫學雜志，2001，36（6）：421-423.

[3]陳燕，周嫣，黎石堅，等.酪蛋白磷酸多肽鈣磷復合體抑制牙釉質脫礦和促進牙釉質再礦化的實驗研究[J].中華口腔醫學雜志，2013，48（1）：32-36.

[4]魏華，石四箴.酪蛋白磷酸多肽聯合鈣磷的抗齲作用[J].復旦學報：醫學版，2003，30（3）：297-298.

[5]漆明，王張，阮梅生，等.α-淀粉酶與蟻齲細菌的相關性研究[J].口腔醫學，2002，22（2）：67-69.

[6]Reynolds EC.Remineralization of enamel subsurface lesions by casein phosphopeptide stabilized calcium phosphate solutions[J]. J Dent Res，1997，76（9）：1587-1595.

[7]趙瓊芝，FanCail.酪蛋白磷酸肽鈣氟磷復合體溶液對牙釉質缺損的再礦化作用[J].實用預防醫學，2001，8（1）：6-8.

[8]Cross KJ，Huq NL，Stanton DP，et al.NMR studies of a novel calcium， phosphate and fluoride delivery vehicle-alpha-casein by stabilized amorphous calcium fluoride phosphate nanocomplexes [J].Biomat，2004，25（20）：5061-5069.

[9]Rose RK.Effects of an anticariogenic casein phosphopeptide on calcium diffusion in streptococcal model dental plaques[J].Arch Oral Biol，2000，45（7）：569-575.

[10]張力，李宗同，石玉琢.磷酸多肽對牙齒再礦化的實驗研究[J].現代口腔醫學雜志，1999，13（1）：15-17.

[11]劉燁，陳溯，張振庭.含氟酪蛋白磷酸肽-磷酸鈣復合物對牙齒耐磨性的影響[J].北京口腔醫學，2012，2（20）：74-76.

[收稿日期]2014-05-12 [修回日期]2014-06-28

編輯/何志斌